增塑劑DEHP暴露對青春期小鼠社會行為的影響

李季穗， 仇軍輝， 陳寒青， 王倩倩， 姚凱旺，張其臻， 胡一中， 徐曉虹

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-ethylhexyl phthalate,DEHP)有良好的成塑性能,因此被大量應用于塑料產品的生產，如醫(yī)療領域的血袋與輸液管、食品包裝及兒童玩具等.人們可經口、呼吸道和皮膚攝入環(huán)境中的DEHP.DEHP具有類雌激素、阻礙雄激素活性的性質，可影響人體性激素的分泌，是一種公認的環(huán)境內分泌干擾物質.因其特性，DEHP對人類生殖發(fā)育的不利影響已經受到了越來越多研究人員的關注[1].最近的實驗表明， 若DEHP暴露于小鼠出生前，就會阻礙其大腦神經的發(fā)育，使鼠的胚胎神經管發(fā)育畸形[2]，下丘腦芳香化酶表達減少[3]，影響下一代的記憶[4-5].青春期是腦發(fā)育和社會認知形成的第2個關鍵時期，此時發(fā)育中的性腺分泌的性激素對性別二態(tài)行為的形成起關鍵作用，所以人體極易受到DEHP等物質的干擾[6].由實驗數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，青春前期給鼠注入DEHP，會降低鼠腦的記憶功能，同時會使鼠產生煩躁感與焦躁感[7].

早期的社會玩耍和交互行為有利于社會技能和社會認知的發(fā)展，對動物的生存和繁衍非常重要，而青春期產生的性激素影響社會行為的性別分化.DEHP有抗雄激素效應[8]，可以影響體內雄激素活動.筆者推測，小鼠若暴露于DEHP，會影響其生長發(fā)育，并且導致成年小鼠的行為發(fā)生異常.黑質紋狀體多巴胺(dopamine,DA)神經遞質系統(tǒng)參與情緒和社會行為的調控，神經元樹突形態(tài)與行為密切相關.因此，在假設青春期DEHP暴露影響成年雄鼠社會行為的基礎上，探討其作用是否與神經元樹突形態(tài)和紋狀體DA遞質系統(tǒng)活動的改變有關.

1 材料和方法

1.1 實驗動物、模型制備與分組

在浙江省醫(yī)科院動物中心采購ICR 3周齡小鼠，正常條件下適應1周，根據(jù)以往實驗數(shù)據(jù)，建立3組DEHP染毒實驗.1,10和50 mg·kg-1·d-1(藥理劑量根據(jù)體表面積換算相當于人0.081,0.810和4.050 mg·kg-1·d-1)[9]和溶媒對照組(花生油).連續(xù)3周對小鼠灌胃染毒DEHP，達到8周齡后進行各項檢測.另每組8只鼠眼眶取血，利用放射免疫法測試小鼠腦內、血清的睪酮水平，同時提取腦紋狀體組織用于蛋白表達檢測，然后稱重分離睪丸，計算睪丸與體重比，即睪丸系數(shù).

1.2 行為測試

行為測試按以下順序進行.全部的實驗通過小動物分析系統(tǒng)采集.為防止小鼠的氣味影響下一個小鼠的行為，需要用75%的乙醇對模型進行消毒去味.

曠場行為觀測箱(40 cm×40 cm×30 cm)平均分成16格，中央?yún)^(qū)是中間4格.用于記錄小鼠在5 min內的跑動穿越格數(shù)、站立次數(shù)、理毛次數(shù)及在中央停留的時間，并且探究小鼠在陌生環(huán)境里是否會自主進行其他活動(n=15).

高架十字迷宮的組成部分有:2個相對封閉臂(30 cm×5 cm×15 cm)、2個相對開放臂(30 cm×5 cm)、連接四臂的中央平臺(5 cm×5 cm)，距離地面50 cm.動物因恐懼于懸空的開放臂產生焦慮情緒，同時又無法抑制對開放臂的好奇而產生沖突的心理活動，在測試過程中以5 min內開放臂下動物所停留時間作為其焦慮情緒，中央?yún)^(qū)域所得探頭次數(shù)體現(xiàn)動物自身的探究意愿，封閉臂及開放臂中動物總的進入次數(shù)代表動物自身活動性(n=15).

在檢測動物的社會玩耍行為時，將小鼠組織在一個形狀為長方形的籠盒(45 cm×35 cm×20 cm)內.記錄15 min內2只相同年齡、性別和處理的陌生小鼠互相爬跨、追逐、打斗、理毛和嗅探等作為玩耍指標，其中互相理毛和嗅探視為社會探索的指標(n=10對)[10].

三室模型由3個隔間的矩形形狀的籠盒(56 cm×29 cm×23 cm)組成，為了方便筒內外的小鼠進行交流溝通，在左右的隔間內各放置了一個不銹鋼材質的圓筒，中隔間兩側分別有門洞允許小鼠自由出入左右隔間.通過記錄5 min內待測小鼠在含陌生鼠圓筒的隔間(社會區(qū)域)和含空圓筒的隔間(非社會區(qū)域)停留時間和對陌生鼠或對空圓筒的嗅探的時間差距(n=20)，來觀察小鼠之間的社會交互能力.如果小鼠在嗅探陌生鼠的時間或在社會區(qū)停留的時間越長，那么其社會交互能力也越強[11].

強迫游泳模型是通過判斷動物對周圍惡劣環(huán)境的敏感性和排斥反應來評價小鼠的抑郁狀態(tài)[12].圓柱形游泳池直徑為30 cm、水深為25 cm.測試時將1只小鼠放入泳池中央，記錄在強迫游泳狀態(tài)下，小鼠在6 min內保持靜止的總時間，時間越長表示抑郁越嚴重(n=15).

1.3 Western blot檢測DAT,AR及D2蛋白

每組取小鼠(8周齡)斷頸處死后取腦，4 ℃下分離雙側紋狀體組織，制備蛋白樣品分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?取10～20 μL的蛋白樣品開展十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白濕轉到硝酸纖維素膜(NC)，封閉4 h，分別加相應一抗(β-actin(1∶800)，AR(1∶600)，DAT(1∶300)，D2(1∶400))(美國Santa Cruze公司)孵育、漂洗.然后對NC膜和辣根過氧化物酶標記后的羊抗兔二抗(1∶2 000)進行孵育，漂洗，并用免疫化學發(fā)光試劑使其著色，經過X光片曝光后進行掃描，最后用Quantity One軟件半定量分析蛋白條的帶光密度.

1.4 新生大鼠海馬神經元離體培養(yǎng)

取出生24 h內的SD大鼠腦，在4 ℃下分離海馬，在35 mm培養(yǎng)皿中的小玻片上制備常規(guī)的神經細胞懸液并在培養(yǎng)皿中多聚賴氨酸包被，細胞密度1×105cells/cm3，培養(yǎng)于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中.4～5 h后，換成Neurobasal+2% B27培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)，在接下來的實驗中每隔3.5 d更換培養(yǎng)液，到了第5 d，使其DEHP的最終濃度分別保持為1,10,100,1 000 nmol/L.在對照組中加入溶媒DMSO(終濃度<0.001%)，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察5 d.4%多聚甲醛固定細胞，鬼筆環(huán)肽濕盒室溫孵育染色，清洗后封片.激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，Meta Morph圖像分析軟件測量樹突棘和樹突絲密度.每組測量3個獨立皿的35個神經元(n=35).

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤差(M±SE)表示，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析DEHP暴露效果，并進行Post-hoc test的Tukey檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義.

2 分析結果

2.1 探討DEHP對血清、腦內睪酮水平及睪丸體重的影響

暴露在1 mg·kg-1·d-1劑量下，DEHP明顯降低了小鼠腦內睪酮水平；DEHP劑量為50 mg·kg-1·d-1時，降低了血清睪酮水平(P<0.05)，但沒有改變其睪丸和體重系數(shù).實驗表明，青春期1,10和50 mg·kg-1·d-1的DEHP暴露不會對雄鼠的生殖器官發(fā)育造成顯著的影響(見圖1).

與對照組相比，具有顯著性差異*( P<0.05)

2.2 探討DEHP對小鼠曠場行為的影響

50 mg·kg-1·d-1DEHP會明顯降低小鼠的跑動格數(shù)(P<0.05)，1,10 和50 mg·kg-1·d-1DEHP會使小鼠站立次數(shù)明顯減少(P<0.05)，表明成年雄鼠的活動性縮減和探究意愿減少與青春期DEHP暴露有關(見圖2).

與對照組相比，具有顯著性差異*( P<0.05)；具有極顯著性差異** (P<0.01)

2.3 探討DEHP對小鼠高架十字迷宮和強迫游泳行為表現(xiàn)的影響

1 mg·kg-1·d-1DEHP明顯減少了小鼠在開放臂的駐留時長(P<0.05)，但對所有臂的總進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)的探頭次數(shù)和開放臂的進入次數(shù)并無明顯影響(見圖3a～3c)；此外，1,10和50 mg·kg-1·d-1DEHP明顯增加了小鼠強迫游泳時停止不動時間(P<0.05，P<0.01)(見圖3d)，這表明，青春期DEHP暴露會影響小鼠的抑郁、焦慮情緒.

與對照組相比，具有顯著性差異*( P<0.05)；具有極顯著性差異** (P<0.01)

2.4 探討DEHP對小鼠社會交互行為和社會玩耍行為影響

在社會玩耍測試中，DEHP暴露不影響雄鼠的玩耍及與陌生鼠的相互接觸次數(shù)(見圖4a～4b)；三室模型的檢測結果顯示，DEHP會明顯減少鼠在社會區(qū)域的駐留時間(P<0.05，P<0.01)，而對其他陌生鼠接觸的時間影響較小(圖4c～4d).結果表明，青春期DEHP暴露會抑制小鼠社會交互能力和探究意愿.

與對照組相比，具有顯著性差異*( P<0.05)；具有極顯著性差異** (P<0.01)

2.5 探討DEHP對小鼠紋狀體內D2，DAT和AR表達情況的影響

成年雄鼠社會行為和情緒與DA遞質系統(tǒng)密切相關.實驗結果表明，DEHP暴露不影響紋狀體DAT表達，但明顯降低了D2和紋狀體AR水平(P<0.01)(見圖5).

與對照組相比，具有顯著性差異*( P<0.05)；具有極顯著性差異** (P<0.01)

2.6 探討DEHP對離體培養(yǎng)的海馬神經元細胞樹突棘密度和樹突絲的影響

對離體培養(yǎng)的海馬神經元，DEHP暴露5 d后顯著減少了海馬神經元樹突絲和樹突棘的密度.結果表明，DEHP抑制離體培養(yǎng)的新生海馬神經細胞樹突的發(fā)育(見圖6).

與對照組相比，具有顯著性差異*( P<0.05)；具有極顯著性差異** (P<0.01)

3 討 論

3.1 青春期小鼠暴露于DEHP加劇焦慮抑郁情緒并抑制社會行為

同一物種的不同個體相互作用而發(fā)生社會行為，以維持生存與繁衍后代的需要.社會玩耍從社會探究開始，表現(xiàn)為2只陌生小鼠通過相互嗅探來熟悉對方，小鼠將進行社會玩耍作為融入社會的開端[10].實驗表明，青春期DEHP暴露對小鼠社會玩耍行為沒有影響，但是在一定程度上減少了相互嗅探和相互接觸等社會探索行為，同時青春期DEHP暴露抑制了小鼠的社會交流意愿及社會探索能力.根據(jù)小鼠在三室模型社會區(qū)域停留時間的降低，以及與陌生小鼠接觸時間的輕微減少，可以得出青春期DEHP暴露降低了小鼠的社會交互能力和社會新奇偏好能力.發(fā)育期間性激素可調節(jié)嚙齒類動物的社會行為，比如雄激素可調節(jié)動物的玩耍打斗，新生兒時期給予睪酮的雌性大鼠社會玩耍行為雄性化[13].社會行為受多因素的影響，但有關環(huán)境內分泌物對社會行為的研究知之甚少.有人發(fā)現(xiàn)，多氯聯(lián)苯可減少雄鼠的社會交互行為[14].DEHP作為一種環(huán)境內分泌干擾物，不僅有類雌激素的性質，同時能抑制雄激素活性,發(fā)揮抗雄激素作用[15].實驗結果表明，青春期DEHP暴露會對小鼠的社會探究和社會交互行為造成抑制效果.據(jù)此推測，DEHP抑制了小鼠體內雄激素的活性，從而抑制了小鼠的社會行為.低焦慮和抑郁狀態(tài)的動物往往表現(xiàn)出較高的社會玩耍和社會交互能力，延長與陌生同伙相互接觸的時間[16].鑒于小鼠在開放臂的停留時間減少和強迫游泳的靜止時間延長的實驗結果，可以得出DEHP導致了小鼠焦慮抑郁情緒的加劇，表明DEHP對小鼠社會行為的抑制效果和焦慮、抑郁情緒的惡化有一定的關聯(lián).

3.2 青春期小鼠暴露于DEHP阻礙腦內神經元樹突的發(fā)育并降低紋狀體AR和D2的表達水平

雄激素調控小鼠的焦慮抑郁情緒和社會行為的作用受到雄激素受體AR的影響[17].有研究表明，在圍生期雄性小鼠海馬腦區(qū)內，由于DEHP暴露，導致其AR表達能力明顯下降，同時還會產生焦慮及抑郁等現(xiàn)象[18].本研究發(fā)現(xiàn)，青春期DEHP暴露不僅影響雄鼠腦和血清睪酮激素水平，還顯著下調了紋狀體AR表達，提示DEHP可能通過下調睪酮水平和AR水平而抑制雄激素對小鼠焦慮和社會行為的調節(jié)作用.AR影響社會行為調節(jié)，同時紋狀體DA遞質也會影響動物情緒和行為.社會玩耍伴隨著前腦DA的傳遞而增加，DA傳遞的阻斷劑可減少社會玩耍[19]，而DA受體激動劑增加社會玩耍[20]；大鼠成年后會伴有抑郁情緒，這種現(xiàn)象的產生與紋狀體DA受體D2表達水平降低有關[21]；表明紋狀體等腦區(qū)的DA系統(tǒng)參與焦慮抑郁情緒和社會玩耍行為.本實驗表明，雖然成年雄鼠其紋狀體DA轉運體(DAT)表達不受到青春期DEHP暴露的影響，但是DA受體D2水平卻因DEHP暴露而明顯下降.此外，我們還發(fā)現(xiàn)，DEHP抑制神經元樹突棘密度.樹突是信息傳遞的關鍵結構，與行為密切相關；而D2介導動物的情緒、行為和運動.因此，DEHP暴露引起的D2水平下降導致的DA遞質系統(tǒng)異常和樹突發(fā)育抑制可能與雄鼠成年后的促焦慮抑郁和社會行為減少有關.

綜上所述，雖然青春期暴露于1，10和50 mg·kg-1·d-1DEHP對生殖器官發(fā)育沒有影響，但是在一定程度上卻減少了小鼠腦內和血清雄激素水平，減少了社會探究和社會交互能力，并加劇焦慮抑郁狀態(tài)；而紋狀體腦區(qū)DA受體D2和AR水平的下調及神經元樹突發(fā)育的抑制可能與其情緒和社會行為的改變有關.若想探明DEHP對小鼠焦慮抑郁情緒和社會行為影響的神經機制，還需進一步設計實驗.同時，筆者使用的DEHP劑量遠遠低于其無不良效應極限值，但仍然加劇了小鼠的焦慮抑郁情緒，并抑制了小鼠的社會行為.因此，應對DEHP低劑量暴露對機體的危害引起足夠的重視.