慢病毒介導的RNA干擾抑制白血病細胞增殖的應用

方金勇， 王 雍， 張熠玲， 王志龍， 徐玲玲， 趙鐵軍

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)基因組為基礎，人工改造構建而成的一種病毒載體.它利用病毒高感染性、高表達性、可感染分裂細胞和非分裂細胞等諸多特性，經(jīng)過感染細胞或組織，從而實現(xiàn)外源基因持續(xù)穩(wěn)定的表達[1].應用最為廣泛的慢病毒載體系統(tǒng)包含整合質粒、包裝質粒和包膜質粒.前者主要含有包裝、逆轉錄及整合所必需的作用原件，且具有多克隆位點及插入到該位點的目的基因；后二者構成了慢病毒載體的包裝系統(tǒng)，提供了慢病毒包裝所需的蛋白質外殼部分.在慢病毒載體構建過程中，將整合質粒、包膜質粒和包裝質粒3種質?；旌?，轉染包裝細胞后，培養(yǎng)收集得到所需的慢病毒載體.

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是生物進化中一項保守的防御機制，它是由雙鏈RNA誘發(fā)同源mRNA發(fā)生特異性降解的過程[2].在細胞中，雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)經(jīng)過核糖核酸內切酶(endonuclease)剪切形成大小為21～26 bp的siRNA，隨后siRNA與其他復合物結合，形成RNA誘導沉默復合物(RNA induced silencing complex,RISC)，在siRNA反義鏈的指導下，RISC結合到與其互補的轉錄產(chǎn)物上，最后特異性地降解目的RNA的過程[3-5].慢病毒載體介導的RNAi利用慢病毒載體將RNAi片段導入宿主細胞，從而抑制同源mRNA的表達.該方法將慢病毒載體的高感染性、高表達性與RNAi的特異性相結合，與其他方式相比，前者具有可使目的基因產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定沉默等顯著優(yōu)點[6-7].

成人T細胞白血病是一類由成人T細胞白血病病毒(human T cell leukemia virus type-1,HTLV-1)感染引起的惡性腫瘤[8-9]，研究者在2002年發(fā)現(xiàn),HTLV-1反義鏈編碼的HBZ蛋白與該病發(fā)生有密切關系[10-13].研究發(fā)現(xiàn),所有ATL病人樣品中均能檢測到HBZ基因的表達，而且HBZ是HTLV-1編碼產(chǎn)物中唯一一個不存在無義突變的基因.HBZ的持續(xù)表達增強了HTLV-1感染細胞的惡性增殖能力.此外，HBZ轉基因鼠呈現(xiàn)全身性炎癥反應，且該轉基因鼠的T細胞淋巴瘤發(fā)生率明顯高于正常小鼠[14]，這表明HBZ的持續(xù)表達在ATL發(fā)病機制中占有重要的意義.

為了探索治療成人T細胞白血病的方法，實現(xiàn)抑制白血病細胞增殖的目的，研究首先構建了表達HBZsiRNA的慢病毒載體，將其感染白血病細胞后發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體介導的RNAi能明顯下調白血病細胞內HBZ的表達，并且白血病細胞的惡性增殖受到了顯著抑制.該研究結果為利用慢病毒載體介導的RNAi治療ATL疾病提供了實驗依據(jù)和工具.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

包裝慢病毒載體的3個質粒，即表達質粒pCSⅡ-U6-MCS-PCMV-EGFP、包裝質粒pCMV-Δ8/9和包膜質粒pcDNA-VSVG由日本京都大學松崗雅雄教授惠贈；293FT細胞(人胚腎細胞)、白血病細胞株TL-Om1同樣來自于松崗雅雄教授；HBZsiRNA片段及PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Taq酶及緩沖液購置于TaKaRa公司；質粒提取試劑盒及凝膠純化試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品；Anti-HBZ抗體由美國教授Green提供；細胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI-1640及脂質體Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；二次抗體購自于Santa Cruze公司；四季青胎牛血清(FBS)來自浙江天杭生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 慢病毒載體的構建

根據(jù)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nuh.gov/)提供的HTLV-1HBZ序列(GenBank Accession編號:DQ273132.1)，使用在線siRNA設計網(wǎng)站siDirect 2.0版(http://sidirect2.rnai.jp/)設計HBZsiRNA序列.HBZsiRNA序列：正義鏈為5′-AGGACAAGGAGGAGGAGGATTCAAGAGATCCT-CCTCCTCCTTGTCCTTTTTTT-3′；反義鏈為5′-AATTAAAAAAAGGACAAGGAGGAGGAGGATCT-CTTGAATCCTCCTCCTCCTTGTCCTGGCC-3′.對照組序列：正義鏈為5′-AGAGGCTTAGGCTTAACCTTAAGAGTTCCTTCCTTCCTTAGAGTTAGGAGCCG-3′；反義鏈為5′-AATTTCTCCGAATCCGAATTGGAATTCTAAGGAAGGAAGGAATCTCAATCCTCG-GCGGCC-3′.上述序列由上海生工合成.室溫下將正義鏈與反義鏈退火粘連形成雙鏈siRNA.隨后將siRNA與酶切后的線性載體連接，轉化至JM109感受態(tài)細胞.挑取菌落，經(jīng)菌落PCR和酶切電泳鑒定陽性克隆后，送往生物公司測序.

1.3 慢病毒的包裝和滴度測定

慢病毒質粒轉染按脂質體轉染法操作，其中重組質粒pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP-HBZ siRNA 15 μg，包裝質粒pCMV-Δ8/9 15 μg和包膜質粒pcDNA-VSVG 7.5 μg在脂質體Lipofectamie 2000的介導下，轉染至293FT細胞.48 h后，收集細胞上清液，經(jīng)過0.22 μm濾器過濾后，28 000 r/min，4 ℃離心2 h收獲沉淀，再使用400 μL 1640+10% FBS+P/S培養(yǎng)基重懸，獲得病毒濃縮液.取20 μL病毒濃縮液加入到12孔板中感染293FT細胞.培養(yǎng)4 d后，利用熒光顯微鏡觀察GFP熒光細胞數(shù)并折算為病毒感染滴度(PFU/mL).

1.4 病毒顆粒感染細胞

感染當天，收集TL-Om1細胞調整細胞密度為1×106個/mL，加入適當Polybrene使其終濃度為3～5 μg/mL，然后將細胞接種于12孔板，每孔體積為1 000 μL.取20 μLHBZsiRNA慢病毒和對照組siRNA慢病毒濃縮液分別加入到12孔板中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱.48 h后，使用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達，確定病毒感染效率.

1.5 感染細胞中HBZ表達水平的檢測

1.5.1 RT-PCR檢測HBZ基因表達水平

用Trizol提取病毒感染后的TL-Om1細胞總RNA，對其進行RNA純化及逆轉錄，運用PCR檢測HBZ轉錄情況.HBZ基因引物上游：5′-TAAACTTACCTAGACGGCGG-3′，下游：5′-CTGCCGATCACGATGCGTTT-3′.內參為GAPDH的引物上游：5′-GCAGGGGGGAGCCAAAAGGG-3′，下游：5′-TGCCAGCCCCAGCGTCAAAG-3′.PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5.2 Western blot定量分析HBZ蛋白表達水平

使用RIPA細胞裂解液提取HBZsiRNA組和Control siRNA組細胞的總蛋白，使用考馬斯亮藍法進行蛋白定量分析，取100 μg蛋白變性.將變性后蛋白以每孔20 μg總蛋白樣進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后按半干轉膜法轉膜(PVDF膜)，5%的脫脂奶粉中封閉2 h，一抗孵育，按抗體說明書上的最佳稀釋濃度稀釋加一抗(1∶2 000稀釋)，4 ℃于冰箱孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，再加入稀釋好的熒光二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，暗室曝光.

1.6 MTT法檢測轉染細胞的增殖

取對數(shù)生長期的病毒感染后的TL-Om1細胞制成細胞懸液，細胞計數(shù)板計數(shù)后，將細胞稀釋至1×105個/mL細胞密度，按100 μL/孔接種細胞于96孔板，每組做3～4個復孔；然后分別繼續(xù)培養(yǎng)細胞(0，24，48，72 h)后，按照10 μL/孔的量加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱連續(xù)孵育4 h；4 h后使用排槍吸取100 μL/孔室溫酸化異丙醇裂解液加入到孔板中，吹打混勻；室溫避光靜置10 min后，放入酶標儀連續(xù)振蕩3 s，在595 nm波長下檢測吸光值(即OD值)，分析細胞生長情況.

1.7 RT-PCR檢測細胞生長相關基因表達情況

RNAi后提取TL-Om1細胞的總RNA.運用PCR技術檢測基因表達情況.PCR產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

2 結 果

2.1 構建HBZ siRNA慢病毒重組載體

為了將HBZsiRNA 片段連接入慢病毒重組載體，需要將載體進行線性化處理.如圖1所示，pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP質粒經(jīng)ApaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，運用凝膠純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，凝膠電泳后得到10.2 kb大小的線性化條帶，符合預期結果，為下一步連接反應提供材料(見圖1).

公司合成的HBZsiRNA進行退火處理形成雙鏈siRNA.利用DNA連接酶將酶切后的pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP線性質粒與雙鏈的HBZsiRNA

圖1 pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP質粒Apa Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切產(chǎn)物鑒定圖

片段4 ℃過夜連接得到重組質粒.重組質粒轉化大腸桿菌后，運用菌落PCR鑒定重組質粒(見圖2).PCR產(chǎn)物均為1.2 kb左右的目的片段，與預期相符.這表明siRNA與載體連接成功，且方向正確.為了進一步驗證該結果，重組質粒經(jīng)EcoRⅠ酶切后，檢測結果與預期相符(見圖3).經(jīng)生物公司測序后，表明插入片段序列正確.上述結果表明，pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP-HBZ siRNA重組質粒構建成功.

M:DNA marker；1—12：重組質粒

M:DNA marker；1—6：重組質粒

2.2 HBZ siRNA慢病毒包裝及滴度測定

重組質粒pCSⅡ-U6-MCS-pCMV-EGFP-HBZsiRNA提取純化后，與包裝質粒pCMV-Δ8/9和包膜質粒pcDNA-VSVG共轉染293FT細胞.通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)98%以上的細胞表達綠色熒光蛋白GFP，表明慢病毒載體在293FT宿主細胞中包裝效率極高(見圖4).慢病毒包裝48 h后收集并濃縮病毒顆粒，滴度測定結果顯示,該慢病毒病毒滴度為1×108PFU/mL，表明本實驗獲得足

A：對照組中GFP的表達情況；B：DAPI熒光染色法檢測對照組細胞；C：實驗組中GFP的表達情況；D：DAPI熒光染色法檢測實驗組細胞

量病毒，能滿足后續(xù)感染實驗的要求.

2.3 RT-PCR檢測siRNA對TL-Om1細胞中HBZ mRNA表達的抑制效果

表達HBZsiRNA的病毒懸液與一定量的Polybrene混合后加入TL-Om1細胞培養(yǎng)基中，細胞經(jīng)離心后轉移至12孔板培養(yǎng).48 h后，收集Control siRNA組和HBZsiRNA組細胞，提取RNA，并運用RT-PCR的方法檢測HBZ的表達.PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后發(fā)現(xiàn)，HBZsiRNA組中HBZ的表達明顯低于實驗對照組，表明慢病毒介導的RNAi感染有效地抑制了HBZ基因的表達(見圖5).

24,26,28 指的是PCR的循環(huán)次數(shù)

2.4 Western blot檢測siRNA對 TL-Om1細胞中HBZ蛋白表達的抑制效果

收集對照組和實驗組的TL-Om1細胞，裂解細胞提取總蛋白，運用Western blot檢測HBZ蛋白的表達情況.如圖6所示，與Control siRNA相比，感染HBZsiRNA病毒的TL-Om1細胞內HBZ蛋白表達水平明顯降低.

圖6 表達質粒轉染TL-Om1細胞Western blot結果

2.5 MTT法檢測TL-Om1細胞生長

慢病毒感染白血病細胞TL-Om1后，將對照組和實驗組細胞接種于96孔板，24,48,72 h后采用MTT法檢測細胞的生長情況，繪制生長曲線.與對照組相比，TL-Om1細胞感染表達HBZsiRNA的慢病毒后，隨著培養(yǎng)時間的增加，實驗組細胞生長活力較對照組明顯受到抑制(見圖7).

圖7 TL-Om1細胞生長曲線

2.6 RT-PCR檢測RNA干擾后細胞生長相關基因的表達

表達HBZsiRNA的慢病毒感染TL-Om1細胞72 h后，運用RT-PCR技術檢測細胞生長相關基因的表達情況.與對照組相比，實驗組TL-Om1細胞內腫瘤細胞生長相關基因如E2F1，PCNA，Myc等的表達受到明顯的抑制(見圖8).

圖8 RNAi后RT-PCR檢測細胞生長相關基因表達情況

綜上所述，慢病毒介導的siRNA方法有效地下調了HTLV-1關鍵蛋白HBZ的表達，從而下調細胞生長相關基因的表達，最終抑制了白血病細胞的惡性增生.

3 討 論

3.1 慢病毒介導的RNAi在腫瘤治療中的運用

由于慢病毒介導的RNA干擾技術能持久、穩(wěn)定、特異性地抑制腫瘤細胞中關鍵致癌基因的表達，且不易誘發(fā)宿主免疫反應[15]，為腫瘤治療提供一個新的技術手段，已成為生物醫(yī)學領域的新熱點[16].例如，CXCL12/CXCR4被證實是惡性腫瘤的一個重要標志物，在食管鱗狀細胞癌(ESCC)中也檢測到該基因的高表達[17-18]，Wang等[19]利用慢病毒載體介導的siRNA技術沉默了ESCC細胞中CXCR4基因的表達.結果顯示，CXCR4基因受到抑制后，細胞凋亡相關基因Bcl-2的表達下降，細胞的生長明顯被抑制并且凋亡增加，而且該慢病毒也有效地抑制了小鼠體內腫瘤的增殖.這為食管鱗狀細胞癌的治療提供了新的方法.在體內治療中，Akhtar等[20]發(fā)現(xiàn)慢病毒介導的RNAi技術下調了在胃癌細胞增殖過程中具有重要作用的stathmin1基因的表達，有效地抑制了人胃癌細胞生長和轉移.上述研究證實，慢病毒介導的RNAi技術對抑制腫瘤細胞的惡性是切實有效的.

3.2 ATL臨床治療的方法及局限性

成人T細胞白血病是一種惡性的淋巴系統(tǒng)疾病[21].當前治療ATL常用的方法有聯(lián)合化學療法、異基因骨髓干細胞移植、分子靶向藥物等[22]，但是ATL患者的治愈情況依舊不容樂觀，而且其預后效果不理想.這主要原因在于：1)在長期使用藥物后，ATL細胞容易產(chǎn)生耐藥性；2)ATL病人呈現(xiàn)免疫缺陷狀態(tài)，易于遭受機會性感染；3)異基因骨髓干細胞移植方法(allo-SCT)[23]使病人機體處于一種免疫缺陷狀態(tài)，若治療中移植感染HTLV-1的供體細胞，仍可導致病人淋巴瘤的發(fā)生.因此，探索一種能有效避免傳統(tǒng)療法帶來負面效果的新型治療手段成為攻克該疾病的關鍵.

3.3 慢病毒介導的siRNA在治療ATL中的可行性

HTLV-1病毒編碼蛋白在ATL發(fā)生過程中扮演極其重要的作用.探索直接以HTLV-1病毒蛋白為靶點，選擇性抑制關鍵基因，從而遏制腫瘤生長的新型治療方法，可以避免傳統(tǒng)治療方式造成的機體免疫缺陷和化療的毒副作用等缺陷.HBZ病毒蛋白是導致ATL的關鍵因素，實驗研究結果表明，慢病毒介導的RNA干擾可以成功抑制HBZ的表達，從而有效降低了ATL細胞的惡性增生，并且白血病細胞內一些與細胞生長相關基因的表達也受到明顯抑制，這為治療ATL提供了有效可行的方法.此外，慢病毒載體是一類較為成熟的基因轉移載體系統(tǒng)，其在基因治療中的運用非常廣泛.在美國FDA批準的基因治療計劃中，半數(shù)以上的計劃都是運用慢病毒載體攜帶治療性藥物導入靶細胞，從而實現(xiàn)藥物的持久長效表達，而且載體可以大量生產(chǎn)，因此，其應用性和市場極為廣泛.我們有理由相信慢病毒介導的RNAi技術作為一種有效的基因治療手段，必將從目前的體外實驗走向更具有實用意義的體內實驗，以HBZ為靶點的基因治療將在ATL的治療中開創(chuàng)更廣闊的臨床應用.