補腎活血方對抗心磷脂抗體（+）復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜及外周血膜聯(lián)蛋白A2和Toll樣受體4的影響研究

馮曉玲，常卓，張璇，陳璐，王煒，趙小萱，趙顏

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是指育齡期婦女與同一性伴侶，連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)的次數(shù)≥2次的一種妊娠疾病。育齡期婦女RSA發(fā)生率約為1%［1］，是一種常見的婦科疑難雜病。盡管對于RSA的病因尚未完全明確，但大多數(shù)學(xué)者認為免疫因素是重要致病因素，其中抗心磷脂抗體（ACA）（+）是已知的和RSA相關(guān)的免疫因素，其通過影響凝血狀態(tài)、血栓形成從而可能導(dǎo)致RSA［2-5］。近年來研究表明，RSA發(fā)生率與ACA陽性率呈顯著正相關(guān)，其可能通過影響凝血狀態(tài)、胎盤血管、前列環(huán)素/血栓素A2、子宮內(nèi)膜容受性等進而影響妊娠過程［6］。所以以ACA為靶點一直是相關(guān)研究的關(guān)注點［7］。西醫(yī)學(xué)對ACA（+）RSA的治療主要集中在抗血栓形成和免疫抑制等方面，常采用阿司匹林、潑尼松以及低分子肝素等抗凝類藥物進行治療［8］。而祖國醫(yī)學(xué)則認為ACA（+）RSA屬于滑胎之腎虛血瘀證，并對癥予以補腎活血法，以補腎為本，活血治標進行標本同治，瘀血祛則胎安、腎氣充則胎固，共奏安胎之效。如《內(nèi)經(jīng)》中“四烏賊骨——藘?nèi)阃琛?，是補腎活血法方藥的先河，張錫純“腎氣丸為補腎之藥，實兼為化淤血之藥”的理論，也提出了補腎活血的安胎原則［9］。本研究是在前期補腎活血方治療ACA（+）RSA的經(jīng)驗［10］基礎(chǔ)上進行的機制研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ACA（+）RSA的發(fā)生與Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）炎性通路及其因子有著密切關(guān)系［11］，所以本研究探討補腎活血方對TLR4/NF-κB炎性通路上的因子〔膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2），TLR4〕及評估妊娠結(jié)局的指標的調(diào)節(jié)作用，進而闡述其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 選取2015年3月—2016年3月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及住院部治療的符合納入標準的ACA（+）RSA現(xiàn)妊娠失敗需行清宮術(shù)患者16例，在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診行正常人工流產(chǎn)者15例，共收集蛻膜樣本31例：ACA（+）RSA者蛻膜為試驗組1（n=16）、正常人工流產(chǎn)者蛻膜為對照組1（n=15），其中試驗組1中1例因流產(chǎn)組織發(fā)現(xiàn)染色體異常故予以排除。兩組年齡、妊娠時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。納入標準：（1）年齡22～42歲。（2）妊娠12周以內(nèi)。（3）試驗組1患者符合ACA（+）RSA西醫(yī)診斷標準及腎虛血瘀型RSA中醫(yī)診斷標準的妊娠失敗患者。根據(jù)第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》［12］修改制定ACA（+）RSA西醫(yī)診斷標準：①病史及癥狀：停經(jīng)12周內(nèi)，出現(xiàn)陰道少量流血，或伴有腰酸、腹痛等癥狀。②妊娠試驗：血、尿妊娠試驗陽性。③婦科檢查：宮頸口未開，宮體軟，子宮大小與停經(jīng)周數(shù)相符。④超聲檢查：子宮大小、孕囊或胚胎發(fā)育與妊娠周數(shù)基本相符。⑤流產(chǎn)史：連續(xù)發(fā)生2次或2次以上自然流產(chǎn)。⑥實驗室檢查：ACA（+）。滿足以上6項方可診斷為ACA（+）RSA。根據(jù)《中藥新藥治療先兆流產(chǎn)的臨床研究指導(dǎo)原則》［13］、《中醫(yī)婦科學(xué)》［14］有關(guān)內(nèi)容結(jié)合臨床修改制定腎虛血瘀型RSA中醫(yī)診斷標準。主證：孕早期①屢孕屢墮，或如期而墮（墮胎次數(shù)≥2次）；②有陰道流血（色暗或夾血塊）；③小腹墜痛；④腰酸。次證：①雙膝酸軟；②頭暈耳鳴；③夜尿頻多。舌脈：舌紫黯或有瘀點，苔薄白，脈細滑或沉澀。上面主證具備①加另外1項或以上，次證具備1項或以上，結(jié)合舌脈即可辨為腎虛血瘀型RSA。（4）對照組1為正常妊娠，無自然流產(chǎn)史，有≥1次正常生育史，實驗室檢查ACA（-），要求進行人工流產(chǎn)。（5）自愿接受并配合研究者。試驗組1排除標準：（1）初診經(jīng)過超聲診斷或者經(jīng)過觀察后診斷為萄萄胎、異位妊娠等者；（2）夫妻雙方或任意一方染色體異常者；（3）超聲及婦科檢查提示生殖器器質(zhì)性病變者，如子宮畸形、生殖道畸形、子宮腫瘤等；（4）病毒十項試驗提示巨細胞病毒、弓形蟲病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒感染者；（5）生殖激素測定提示內(nèi)分泌異常者；（6）男方精液常規(guī)異常者；（7）合并心血管、腦血管、肝腎造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病，精神病患者；（8）近期服用其他藥物，致試驗結(jié)果難以判斷者。脫落標準：入組后，發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常等其他病因造成RSA者。

表1 對照組1和試驗組1年齡、妊娠時間比較（x±s）Table 1 Comparison of age and days of pregnancy between control group 1 and test group 1

1.1.2 選取2015年3月—2016年3月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及住院部治療的符合研究標準的要求行保胎治療的ACA（+）RSA患者11例（試驗組2），在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診行正常孕檢者13例（對照組2），收集其血清樣本，其中試驗組2中1例自然流產(chǎn)，對照組2中3例自動退出，未計入統(tǒng)計數(shù)據(jù)。兩組年齡、妊娠時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。納入標準：（1）年齡22～42歲；（2）妊娠6～8周；（3）試驗組2：符合ACA（+）RSA西醫(yī)診斷標準及腎虛血瘀型RSA中醫(yī)診斷標準者（診斷標準參見1.1.1）；（4）對照組2：正常妊娠于本院門診進行常規(guī)產(chǎn)前檢查者；（5）自愿接受并配合研究者。排除標準：同1.1.1。脫落標準：（1）入組后，未按規(guī)定劑量服用藥物或自行停藥者；（2）入組后，發(fā)現(xiàn)其他造成RSA確切病因者；（3）治療過程中，自行退出或拒絕治療后再次采血者。

表2 對照組2和試驗組2年齡、妊娠時間比較（x±s）Table 2 Comparison of age and days of pregnancy between control group 2 and test group 2

1.2 主要試劑 DEPC原液（廣州市藍博生物技術(shù)有限公司）、TRLZOL Reagents（美國Invitrogen公司）、 無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、三氯甲烷（天津市博迪化工有限公司）、異丙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、dNTP（2.5 mmol/L）〔天根生化科技（北京）有限公司）〕、0.1 mol/L DTT（Beye time公司）、OligodT（美國Thermo Scientific公司）、Taq DNA Polymerase（美國 Thermo Scientific 公司）、5× 反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer（美國 Thermo Scientific公司）、10×PCR Buffer （美國 Thermo Scientific 公司）、Rnase Inhabitor （美國 Promega 公司）、M- MLV Reverse Transcriptase（美國 Promega公司）、Human ANXA2 ELISA kit試 劑 盒、Human TLR4 ELISA kit試劑盒。

1.3 主要儀器 電子精密天平（Discovery DV215CD）（美國 OHAUS 公司）、NanoPhotometerTMP -Class 超微量紫外分光光度計（德國 Implen公司）、高速組織勻漿器T1000（德國 IKA公司）、渦旋器（德國 IKA公司）、高速冷凍離心機（美國BECKMANCOULTER公司、型號：Alegra 21R）、羅氏RT-qPCR儀（美國Thermo Scientific 公司）、全自動酶標儀（ELX808）（BioTek Instruments.Inc）、DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、318W型洗板機（上海三科儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 在冰上提取蛻膜組織RNA，用NanoPhotometerTMP-Class超微量紫外分光光度計測定提取對照組1和試驗組1蛻膜組織RNA純度。記錄RNA濃度后將組織樣品凍存于-80 ℃冰箱。根據(jù)美國 Thermo Scientific公司RT-qPCR試劑盒，嚴格按照說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA于-80 ℃保存。然后通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站進入Genbank數(shù)據(jù)庫，查找 GAPDH mRNA、 ANXA2 mRNA 以及 TLR4 mRNA 全基因序列，應(yīng)用上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計的引物合成引物序列：ANXA2正向引物為512 3-TGAGCGGGATGCTTTGAAC-312 3，反向引物為 512 3-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-312 3；TLR4正向引物為512 3-TGCAATGGATCAAGGACCAGAGGC-312 3，反向引物為512 3-GTGCTGGGACACCACAACAATCACC-312 3；內(nèi)參GAPDH正向引物為512 3-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-312 3，反向引物為512 3-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -312 3。最后采用RT-qPCR 法測定 ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA 水平，使用2x SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒，反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 30 s，總共 50 個循環(huán)，72℃延伸30 s。經(jīng)過兩步法擴增后得出Ct數(shù)值，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達水平。

1.4.2 試驗組2從入組留取血清樣本后即給予補腎活血方，藥物組成：丹參 20 g、菟絲子 15 g、續(xù)斷 15 g、桑寄生 15 g、阿膠（烊化）15 g、黃芪15 g，根據(jù)患者情況隨證加減，煎藥至300 ml湯劑，早晚分服，治療4周。以上中藥湯劑由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局及煎藥室提供。對照組2不采取任何干預(yù)方法。檢測兩組患者治療前及治療后血清孕酮、β人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）、ANXA2、TLR4水平。

首先將血清樣本常溫下解凍備用，在酶標板上設(shè)置標準品孔5孔，稀釋后濃度分別為240、160、80、40、20 μg/L（Human ANXA2 ELISA kit試劑盒），及 18、12、6、3、1.5 ng/ml（Human TLR4 ELISA kit試劑盒），然后加待測樣品 10 μl，37 ℃溫育30 min；酶標板每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次。然后分別加入50 μl酶標試劑于待測樣品孔中，使之混勻，后重復(fù)溫育、洗滌。加入顯色劑 A 50 μl、B 50 μl，混勻、避光。于每孔中加入50 μl終止液，最后于ELX808全自動酶標儀450 nm波長處依序測量各孔OD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，同組治療前后比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組1和試驗組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA水平比較 對照組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA水平高于試驗組1，TLR4 mRNA水平低于試驗組1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.2 對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較 治療前對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。試驗組2治療后血清孕酮、β-HCG、ANXA2水平高于治療前，血清TLR4水平低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

3 討論

RSA是一種常見的妊娠疾病，不僅給患者自身帶來了極大的痛苦和心理壓力，也給家庭及社會帶來不良影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ACA（+）是導(dǎo)致RSA的常見因素之一，也成為了研究熱點［2-5］。ACA是一種自身免疫性抗體，其可以通過誘導(dǎo)凝血，或影響不同因子損害蛻膜血管內(nèi)皮細胞，形成血栓傾向，從而使胚胎在發(fā)育過程中缺血缺氧，進而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生［15］。馮曉玲等［11］研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠者相比，ACA（+）RSA者體內(nèi)的TLR4/NF-κB炎性通路呈活化狀態(tài)，其通路上的炎性因子也有相應(yīng)變化。其中ANXA2和TLR4是該條通路上與血栓、炎癥相關(guān)的因子，所以本研究基于此背景，收集ACA（+）RSA者和正常妊娠者蛻膜、血清，探討ANXA2、TLR4在ACA（+）RSA中的表達以及其與該疾病的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，對照組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA水平高于試驗組1，TLR4 mRNA水平低于試驗組1，試驗組2治療前血清ANXA2水平低于對照組2，TLR4水平高于對照組2。提示這種變化可能與ACA（+）存在相關(guān)性，發(fā)生機制可以從ANXA2、TLR4與血栓形成傾向、前列腺素合成、炎癥、滋養(yǎng)細胞凋亡等角度進行解釋。有動物實驗證實了ANXA2基因敲除的小鼠不能完全清除損傷后所形成的動脈血栓，證明了其對防止血栓形成的積極作用［16-17］。KIM等［18］研究也證明ANXA2能明顯抑制栓塞性腦卒中大鼠模型體內(nèi)血栓形成。ZHANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)足月蛻膜感染時，可檢測到TLR4表達于炎性細胞表面。PIERANGELI等［20］研究發(fā)現(xiàn)，TLR4可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞凋亡，促進炎性因子和前列腺素分泌，繼而導(dǎo)致早產(chǎn)。所以，ACA（+）RSA者蛻膜中ANXA2 mRNA水平降低，TLR4 mRNA水平升高，可引起ACA（+）改變，使蛻膜呈現(xiàn)血栓傾向，從而引發(fā)流產(chǎn)。

表3 對照組1和試驗組1蛻膜組織中ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA水平比較（x ±s）Table 3 Comparison of the expression of ANXA2 mRNA，TLR4 mRNA in decidua tissues between the control group 1 and the test group 1

表4 對照組2和試驗組2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比較（x±s）Table 4 Comparison of the expression of progesterone，β-HCG，ANX A2 and TLR4 in blood serum between the control group 2 and the test group 2

ACA（+）RSA與中醫(yī)滑胎病之腎虛血瘀證的臨床表現(xiàn)、致病機制等大致相同［21］。瘀血阻滯沖任，新血不能灌注胞宮，使胞宮不能養(yǎng)胎，致墮胎。數(shù)次墮胎耗氣傷血，損傷沖任胞宮久病致瘀，瘀血停滯，從而引起反復(fù)自然流產(chǎn)的發(fā)生。本病血瘀為標，腎虛為本，應(yīng)用補腎活血之法進行治療［22-25］。本研究結(jié)果顯示，ACA（+）RSA者血清中ANXA2水平較治療前升高，而TLR4水平較治療前降低。提示補腎活血方有利于維持妊娠，其機制可能是通過調(diào)節(jié)ANXA2、TLR4。補腎活血方不僅可以在妊娠期間提高激素水平，還可從抗炎、抗凝等分子基礎(chǔ)上對ACA（+）RSA進行根本治療。既往研究表明，補腎活血方可顯著提高ACA（+）RSA患者孕酮水平，藥物有效率高［26］。補腎活血方以丹參活血調(diào)經(jīng)，養(yǎng)血補血為君藥，菟絲子、續(xù)斷、桑寄生補腎安胎共為臣藥，輔以阿膠、黃芪補血益氣，共奏補腎活血安胎之功。藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，補腎活血方的藥物成分可以改善微循環(huán)，促進血液流速，降低血液黏度，抑制血小板聚集和凝血功能，對抗血栓形成［27］。亦有研究發(fā)現(xiàn)補腎活血類中藥可以改善炎性環(huán)境，對TLR4/NF-κB炎性通路具有一定調(diào)節(jié)作用［28］。

綜上所述，ACA（+）RSA的發(fā)生可能與ANXA2低表達、TLR4高表達相關(guān)，補腎活血方可以通過上調(diào)ANXA2、下調(diào)TLR4抑制ACA（+）RSA患者血清高凝狀態(tài)，改善炎性環(huán)境，進而改善妊娠結(jié)局。

作者貢獻：馮曉玲、常卓進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，撰寫論文，對文章整體負責、監(jiān)督管理；常卓、張璇進行研究的實施與可行性分析；張璇、趙顏進行數(shù)據(jù)收集；常卓進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)處理，對結(jié)果進行分析與解釋；常卓、趙小萱進行論文的中文修訂；常卓、王煒進行論文的英文修訂；常卓、陳璐、王煒負責文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。