大鼠H9c2心肌細(xì)胞有氧氧化及無氧酵解的影響因素探討

， ，，，，， ，，

由于各種心臟疾病及其他基礎(chǔ)疾病的影響，心臟心室充盈及射血能力受到損傷引起慢性充血性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的發(fā)生和發(fā)展。CHF病程長(zhǎng)且進(jìn)行性加重，其進(jìn)展具有不可逆性，發(fā)病率和死亡率逐年增加，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。近年來大量研究開始關(guān)注心肌細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)在CHF中的作用[1]。在心力衰竭過程中，心肌細(xì)胞能量代謝與心力衰竭進(jìn)展密切相關(guān)，心肌細(xì)胞能量合成可以保持心臟基本物質(zhì)代謝的穩(wěn)定，從而維持心臟功能并滿足機(jī)體各個(gè)臟器代謝需要。由于脂肪酸和糖類的代謝失衡，造成心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝方式的變化，從而引起心肌內(nèi)部結(jié)構(gòu)損傷功能障礙。因此，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝方式可成為治療心力衰竭的新方法。

在常氧條件下，心臟中>95%的三磷酸腺苷(ATP)來自線粒體的氧化磷酸化。余下的5%主要來自糖酵解，較少部分來自三羧酸循環(huán)[2]。糖酵解過程發(fā)生在細(xì)胞基質(zhì)中，產(chǎn)生的乳酸釋放H+到細(xì)胞外，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)胞外H+釋放速率(extracellular acidification rate，ECAR)了解糖酵解的活躍程度。線粒體有氧呼吸發(fā)生在線粒體內(nèi)膜上，特點(diǎn)是消耗氧氣，因此線粒體有氧呼吸越旺盛表明線粒體功能越旺盛。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)氧氣消耗速率(oxygen consumption rate，OCR)，了解線粒體有氧呼吸功能。細(xì)胞能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)利用檢測(cè)O2壓力和pH值，定量反映了無氧酵解和有氧氧化的過程。本實(shí)驗(yàn)擬以H9c2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，利用細(xì)胞能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)其無氧酵解和有氧氧化參數(shù)，為后期檢測(cè)中藥參附益心顆粒對(duì)缺氧心肌細(xì)胞能量代謝的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 大鼠H9c2心肌細(xì)胞株：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑和材料 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自BI公司；Seahorse XF培養(yǎng)基、Seahorse XF水化液、水化板、培養(yǎng)板、糖酵解壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)試劑盒、線粒體有氧氧化壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)SEAHORSE公司；葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉購(gòu)自SIGMA公司，NaOH及其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 日本Olympus CK-40倒置顯微鏡，蘇州安泰BCM-1300生物潔凈工作臺(tái)，美國(guó)Milli-Q超純水儀，美國(guó)Seahorse XF24孔細(xì)胞能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 大鼠H9c2細(xì)胞株在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基、37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，生長(zhǎng)至融合80%～90%時(shí)棄培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗1次，加入0.125%胰酶消化2 min，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落，立刻加入2 mL DMEM低糖培養(yǎng)液終止消化，用吸管吹散并轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min離心5 min，重懸于新培養(yǎng)液，按1∶2進(jìn)行傳代，36～48 h換液1次。

1.4.2 糖酵解壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn) 根據(jù)糖酵解壓力測(cè)試試劑盒(seahorse XF glycolysis stress test assay)操作。簡(jiǎn)述如下：細(xì)胞以孔密度0.5×104、1×104、1.5×104、2×104接種于Seahorse XF24孔板中，每孔先加入100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后補(bǔ)加至250 μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每行設(shè)置一個(gè)只加培養(yǎng)基的孔作為空白對(duì)照孔；同時(shí)將水化液置于水化板中，每孔1 mL，置于37 ℃，無CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；同時(shí)配置糖酵解培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺終濃度為10 μmol/L)，調(diào)節(jié)pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

16 h培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞密度，吸棄生長(zhǎng)培養(yǎng)基，更換37 ℃，無CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱的糖酵解培養(yǎng)基，根據(jù)4個(gè)Blank孔內(nèi)液體剩余量估計(jì)液體損失量，吸出180 μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入1 mL糖酵解培養(yǎng)基，再吸棄1 mL糖酵解培養(yǎng)基，該清洗步驟重復(fù)2次，最后加入450 μL糖酵解培養(yǎng)基，使最終溶液定容為500 μL。放入37 ℃，無CO2培養(yǎng)箱平衡1 h。此時(shí)用糖酵解培養(yǎng)基配置葡萄糖(glucose)、寡霉素(oligomycin)及2-脫氧葡萄糖(2-DG)，使其終濃度分別為100 μmol/L、100 μmol/L和500 μmol/L。在將寡霉素進(jìn)行10倍稀釋使其終濃度為10 μmol/L。

將水化好的探針取出，仰視板底觀察是否有氣泡，如果有，需要將較大的氣泡除去。將水化板抬離液面，放下，再抬起，再放下，如此重復(fù)10次，直到看不到肉眼可見氣泡為止。然后在每個(gè)水化板四周的A/B/C孔內(nèi)分別加入葡萄糖56 μL、寡霉素62 μL、2-DG 69 μL，加樣應(yīng)勻速輕柔，防止試劑通過噴液口流出。取下水化板中間粉色的支架，將水化板放入預(yù)熱開機(jī)的機(jī)器中，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)。平衡校準(zhǔn)20 min后，托盤彈出，將彈出的透明板取出，更換細(xì)胞板，運(yùn)行糖酵解壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)。運(yùn)行完畢后，使用wave2.3軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4.3 線粒體有氧氧化壓力測(cè)試(cell mito stress test)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)線粒體功能壓力測(cè)試試劑盒操作。簡(jiǎn)述如下：細(xì)胞以2×104/孔密度接種于Seahorse XF24孔板中，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)配置線粒體有氧氧化培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺終濃度10 μmol/L，丙酮酸鈉10 μmol/L，葡萄糖10 μmol/L)，調(diào)節(jié)pH至7.4，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?6 h培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞密度，吸棄生長(zhǎng)培養(yǎng)基，更換37 ℃，無CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱1 h至室溫的線粒體有氧氧化培養(yǎng)基，根據(jù)4個(gè)Blank孔內(nèi)液體剩余量估計(jì)液體損失量，吸出180 μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入1 mL線粒體有氧氧化培養(yǎng)基，再吸棄1 mL線粒體有氧氧化培養(yǎng)基，該清洗步驟重復(fù)2次，最后加入450 μL線粒體有氧氧化培養(yǎng)基，使最終溶液定容為500 μL。放入37 ℃，無CO2培養(yǎng)箱平衡1 h。此時(shí)用線粒體有氧氧化培養(yǎng)基配置寡霉素、碳酰氰-4-三氟甲氧基苯胺[carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone，F(xiàn)CCP]、抗霉素A/魚藤酮混合物(antimycin A&rotenone)，使其終濃度分別為100 μmol/L、100 μmol/L和500 μmol/L。再將FCCP進(jìn)行一系列稀釋，使其終濃度為0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L。

將水化好的探針取出，仰視板底觀察是否有氣泡，按照前述方法除去氣泡。然后在每個(gè)水化板四周的A/B/C孔內(nèi)分別加入寡霉素56 μL，不同濃度的FCCP 62 μL，抗霉素A/魚藤酮混合物69 μL，加樣應(yīng)勻速輕柔，防止試劑通過噴液口流出。取下水化板中間粉色的支架，將水化板放入預(yù)熱開機(jī)的機(jī)器中，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)。平衡校準(zhǔn)20 min后，托盤彈出，將彈出的透明板取出，更換細(xì)胞板，運(yùn)行線粒體有氧氧化壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)。運(yùn)行完畢后，使用wave2.3軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 糖酵解壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn) 糖酵解過程中，糖酵解過程發(fā)生于細(xì)胞基質(zhì)，代謝產(chǎn)物乳酸可釋放H+到胞外，因此，檢測(cè)微量環(huán)境中H+變化，也就是pH值的變化速率能夠反映糖酵解程度。如圖1A所示，第一步加入足量的葡萄糖，可以理解細(xì)胞對(duì)葡萄糖代謝的基礎(chǔ)值。第二步加入寡霉素，實(shí)驗(yàn)證實(shí)寡霉素作用于線粒體氧化呼吸鏈中的ComplexV，它可以充分抑制有氧呼吸，阻斷線粒體有氧呼吸ATP合成，細(xì)胞為了維持能量供給，會(huì)上調(diào)糖酵解功能，產(chǎn)生大量乳酸，可檢測(cè)到最大的胞外H+釋放速率。第三步加入2-脫氧葡萄糖，葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。可以被己糖激酶磷酸化成為磷酸2-脫氧葡萄糖(2-GD-p)在細(xì)胞中累積，抑制糖酵解第一步反應(yīng)，阻斷葡萄糖代謝。

結(jié)果如圖1B所示，每孔細(xì)胞密度0.5×104、1×104、1.5×104、2×104糖酵解的最大值隨著接種密度的增加而增大。結(jié)合速率進(jìn)行比較，每孔細(xì)胞密度1.5×104、2×104為比較合適的細(xì)胞密度。糖酵解、糖酵解效率、糖酵解儲(chǔ)備值比較，1.5×104、2×104是合適濃度，詳見圖2。

Glucose：葡萄糖；Oligomycin：寡霉素；Glycolysis：糖酵解；Glycolytic capacity；糖酵解效率；Glycolytic Reserve:糖酵解儲(chǔ)備

圖1糖酵解壓力測(cè)試曲線

圖2 不同細(xì)胞密度對(duì)葡萄糖酵解能力參數(shù)比較

2.2 線粒體有氧氧化壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)FCCP濃度篩選 如圖3A所示，未加試劑之前OCR值反映了基礎(chǔ)呼吸的數(shù)值。第一步加入寡霉素，實(shí)驗(yàn)證實(shí)寡霉素可抑制線粒體氧化呼吸鏈中的COMPLEX V的功能，破壞線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電位差/抑制ATP合成。細(xì)胞培養(yǎng)基中加入寡霉素可觀察到細(xì)胞的有氧呼吸速率下降，下降的差值即為用于ATP合成所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞氧消耗值。第二步加入不同濃度FCCP，F(xiàn)CCP是解偶聯(lián)劑，可以恢復(fù)線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電位差，恢復(fù)電子傳遞鏈的功能，從而激發(fā)線粒體最大有氧呼吸。最大值與初始值之間的差值，即為細(xì)胞的線粒體有氧呼吸儲(chǔ)備值。

第三步加入抗霉素A/魚藤酮混合物，抑制線粒體有氧呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的功能，全面阻遏線粒體有氧呼吸，此時(shí)細(xì)胞有氧呼吸降低至最低值。圖3B所示，不同濃度(0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)的FCCP刺激H9c2細(xì)胞，可引起細(xì)胞最大有氧呼吸產(chǎn)生不同的最大值。2 μmol/L FCCP刺激H9c2細(xì)胞可產(chǎn)生最大有氧呼吸值。因此，結(jié)合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)選擇2 μmol/L的FCCP刺激H9c2細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

2.3 不同濃度FCCP對(duì)線粒體有氧氧化壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)中參數(shù)的影響 不同濃度(0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)的FCCP刺激H9c2細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)選擇能夠激發(fā)出線粒體有氧呼吸最大值所對(duì)應(yīng)的FCCP濃度為最適FCCP濃度，即2 μmol/L。儲(chǔ)備呼吸功能在2 μmol/L達(dá)到最大值，有氧氧化基礎(chǔ)值、電子漏及ATP產(chǎn)生指標(biāo)沒有顯著差異。詳見圖4。

A：線粒體有氧氧化曲線；B：不同濃度FCCP引起線粒體呼吸功能最大值的濃度篩選。Oligomycin：寡霉素；AntimycinA&Rotenone：抗霉素A/魚藤酮混合物

圖3線粒體有氧氧化壓力測(cè)試實(shí)驗(yàn)

Basal：有氧氧化基礎(chǔ)值；spare respiratory capacity：儲(chǔ)備呼吸功能；proton leak：電子漏；ATP production：ATP產(chǎn)生

圖4線粒體壓力實(shí)驗(yàn)OCR結(jié)果

3 討 論

慢性心力衰竭是一種因心臟充盈和射血功能衰減而使循環(huán)血量不能滿足全身代謝需求的病理生理綜合征[3]，是各種器質(zhì)性心臟病的終末階段。在心力衰竭發(fā)病率中，缺血性心臟病占心力衰竭的75%左右[4]。在我國(guó)，由冠心病導(dǎo)致的心力衰竭是心力衰竭的常見類型。心肌重構(gòu)是心力衰竭病程進(jìn)展中的主要病理生理變化，而心肌能量代謝紊亂直接或間接促進(jìn)了心肌重構(gòu)。

van Bilsen等[5]提出了衰竭心肌的代謝重構(gòu)(metabolic remodeling)概念，即心力衰竭時(shí)，心肌細(xì)胞葡萄糖、脂肪酸、乳酸、氨基酸等物質(zhì)代謝紊亂引起心臟能量代謝途徑改變，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能異常的現(xiàn)象。心力衰竭時(shí)的代謝重構(gòu)可導(dǎo)致心肌收縮功能不全和心室重構(gòu)進(jìn)展，在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，在心力衰竭防治領(lǐng)域開展心肌代謝重構(gòu)的干預(yù)機(jī)制研究具有重要意義。

正常心臟維持心肌基礎(chǔ)代謝和收縮功能的大量ATP主要由脂肪酸(FA)和葡萄糖的氧化產(chǎn)生，乳酸、酮體和氨基酸則是能量的次要來源[6]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)心力衰竭心肌細(xì)胞中ATP大量減少，其濃度僅僅為正常心肌的70%以下，隨著心力衰竭的進(jìn)展，心肌細(xì)胞中ATP含量逐漸減少，且呈進(jìn)行性加重的趨勢(shì)。同時(shí)，心力衰竭心肌細(xì)胞產(chǎn)生能量利用梯度障礙：如ATP利用活性降低，心肌纖維攝取的ATP總量減少，呼吸鏈的電子傳遞活性減弱。線粒體是能量生成的主要場(chǎng)所，心肌細(xì)胞代謝所需能量主要來自線粒體。在長(zhǎng)期缺血缺氧情況下，衰竭的心肌細(xì)胞受到大量有害物質(zhì)如氫離子、乳酸、自由基等的攻擊以致線粒體受損，同時(shí)心肌線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)異常，心肌細(xì)胞呼吸鏈和ATP酶的活性降低，電子傳遞體完整性不足，以上效應(yīng)逐漸積累，導(dǎo)致線粒體內(nèi)氧化磷酸化能力減弱，以致衰竭心肌能量生成障礙，加速了心力衰竭的進(jìn)程。

中醫(yī)傳統(tǒng)文獻(xiàn)中無“心力衰竭”名稱，根據(jù)臨床特征本病可歸屬于中醫(yī)“喘證”“心悸”“心痹”“心水”“水腫”等范疇，現(xiàn)統(tǒng)一命名為“心衰病”。心衰病的中醫(yī)證候主要為氣虛血瘀、陽(yáng)虛水停，故益氣溫陽(yáng)、活血利水為其基本治法。在我國(guó)，中醫(yī)藥已經(jīng)成為心力衰竭綜合治療的重要手段之一，心力衰竭是心血管領(lǐng)域中醫(yī)藥防治的優(yōu)勢(shì)病種。近年來，諸多研究證明中醫(yī)藥治療心力衰竭不僅可控制癥狀、改善預(yù)后，且對(duì)心肌能量代謝有一定的改善作用。如益氣活血中藥(心復(fù)康口服液)可增加心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中ATP含量，上調(diào)GLUT1基因的表達(dá)，有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌能量代謝[7]。益氣溫陽(yáng)方可以有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠模型心臟功能，同時(shí)提高心力衰竭大鼠心肌能量代謝產(chǎn)物ATP含量，減少一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)的含量，有效調(diào)節(jié)心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌能量代謝紊亂[8]。參附益心顆粒可改善心力衰竭模型的心功能，減慢心率，降低血清ANP、BNP和心肌 AngⅡ水平，改善線粒體形態(tài)。提高心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性，恢復(fù)心肌能量代謝[9-13]等。

細(xì)胞能量代謝檢測(cè)系統(tǒng)利用檢測(cè)O2壓力和pH值，定量反映了無氧酵解和有氧氧化的過程，已經(jīng)在很多細(xì)胞類型中進(jìn)行能量代謝的檢測(cè)[14-15]。細(xì)胞密度和FCCP濃度是影響有氧氧化和無氧酵解功能測(cè)定的主要因素，H9c2心肌細(xì)胞以8×104/孔細(xì)胞密度接種，F(xiàn)CCP濃度2 μmol/L刺激細(xì)胞將適合細(xì)胞線粒體功能的檢測(cè)，這為后期進(jìn)行參附益心顆粒對(duì)離體的心肌細(xì)胞線粒體能量代謝的保護(hù)作用提供了研究基礎(chǔ)。