丹參飲預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷大鼠的心肌保護(hù)作用研究

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急性心肌梗死是危害生命安全的危重急癥，治療的關(guān)鍵在于及時(shí)、有效地恢復(fù)缺血心肌的血液再灌注，如及時(shí)地進(jìn)行溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)(PCI)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)等再灌注治療，然而心肌缺血一定時(shí)間后再恢復(fù)血流供應(yīng)，常常會(huì)引起缺血心肌細(xì)胞損害加重的現(xiàn)象，造成心肌細(xì)胞凋亡和壞死的加重，即心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)[1]。如何避免或減輕MIRI已成為臨床上治療急性心肌梗死、恢復(fù)心肌血供過程中亟須解決的一大難題。本研究擬觀察具有活血化瘀、行氣止痛的中藥復(fù)方丹參飲預(yù)處理對(duì)MIRI的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)，健康雄性成年Wistar大鼠60只，體重180～200 g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXX(滬)：2012-0002。

1.2 藥物制備 丹參飲：由丹參、砂仁、檀香組成，藥材按比例由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室購置，經(jīng)浸泡、煎煮、去渣，濃縮藥液濃度至1 g/mL(含生藥)，保存?zhèn)溆?。環(huán)孢菌素A購自碧云天(S1563)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、缺血/再灌注(I/R)模型組、環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組、丹參飲預(yù)處理I/R組，每組15只。按大鼠和人的換算量，灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物，空白對(duì)照組、I/R模型組給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組給予環(huán)孢菌素A 10 mg/(kg·d)，丹參飲預(yù)處理I/R組給予丹參飲生藥劑量4.2 g/(kg·d)灌胃，每日灌藥1次，持續(xù)1周，最后1次用藥后1 h行心肌I/R實(shí)驗(yàn)。

1.4 大鼠心肌I/R模型制作方法 參考文獻(xiàn)[2]，Wistar大鼠使用苯巴比妥腹腔注射麻醉，氣管插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，用銀針探頭接大鼠四肢，連接心電圖機(jī)，記錄心電圖。剔除其左側(cè)胸部毛，75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)，經(jīng)第3～4肋間橫行剪開胸部皮膚、胸大肌、前鋸肌及肋間肌肉，暴露大鼠心臟，將大鼠改為右側(cè)臥位。鈍性剝開心包膜及胸腺，暴露左心耳及左心室，用8-0無損傷線于左心耳下緣下2 mm進(jìn)針，右1/3處出針，結(jié)扎左前降支。結(jié)扎左前降支時(shí)將一紗布網(wǎng)墊置于結(jié)扎處，避免損傷血管，心電圖顯示ST段抬高，結(jié)扎心肌變白即為成功，結(jié)扎30 min后將絲線結(jié)松開，再灌注120 min后結(jié)束實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組大鼠行開胸及心臟穿線，但不打結(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速摘取心臟，用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.5 心肌梗死面積檢測 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法檢測。I/R實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開胸，迅速取下心臟，用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗干凈。主動(dòng)脈逆向插管，預(yù)冷的PBS沖洗心臟至無血液為止，然后經(jīng)主動(dòng)脈注入TTC，37 ℃孵育半小時(shí)后，壞死心肌呈現(xiàn)白色，非壞死心肌呈紅色，-80 ℃冷凍10 min后，切成1.0 mm厚的薄片，10%甲醛溶液固定過夜。佳能數(shù)碼相機(jī)拍照，使用Image J軟件計(jì)算左室心肌壞死面積(IA白色區(qū))和左室危險(xiǎn)區(qū)(AAR：紅色區(qū))。心肌梗死面積使用IA/AAR百分比表示。

1.6 線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即摘取心臟，PBS清洗干凈后，切成1～2 cm3的心肌組織塊，放入2.5%戊二醛固定，漂洗，鋨酸固定，再漂洗，乙醇脫水，包埋，切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，使用透射電鏡(TEM)觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.7 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放程度測定 利用觀察Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹程度法測定線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放的情況，大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束后，取左室心尖部心肌，線粒體提取成功后，立即按照純化線粒體膜通道比色法檢測試劑盒(購自上海一基實(shí)業(yè)有限公司)測定。移取20 μL線粒體樣品到96孔板對(duì)應(yīng)孔里，加入170 μL室溫預(yù)熱的緩沖液，混勻，室溫靜置1 min，記錄初始讀數(shù)InitialA440，即刻加入CaCl2誘導(dǎo)劑作用于線粒體，采用酶標(biāo)儀每隔30 s連續(xù)測定30 min內(nèi)A440 吸光度的變化，計(jì)算吸光值比值(A440/InitialA440)的動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié) 果

2.1 心肌缺血和再灌注時(shí)心電圖的表現(xiàn) 大鼠左前降支結(jié)扎后心電圖顯示：ST段弓背向上抬高，前降支復(fù)流再灌注2 h后心電圖ST段回落。詳見圖1。

圖1 缺血/再灌注時(shí)心電圖的表現(xiàn)

2.2 丹參飲預(yù)處理對(duì)于I/R大鼠心肌梗死面積的影響 丹參飲預(yù)處理I/R組心肌梗死面積為(28±4)%，環(huán)孢菌素預(yù)處理組的心肌梗死面積為(25±7)%，I/R模型組大鼠心肌梗死面積為(44±3)%。與I/R模型組比較，丹參飲預(yù)處理I/R組、環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組心肌梗死面積均縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而丹參飲預(yù)處理I/R組和環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。

與I/R模型組比較，*P<0.05

圖2各組心肌梗死面積比較

2.3 丹參飲預(yù)處理對(duì)于I/R大鼠心肌的線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，空白對(duì)照組為正常線粒體，可見完整的線粒體內(nèi)外膜、清晰的線粒體嵴結(jié)構(gòu)以及致密的基質(zhì)結(jié)構(gòu)；I/R模型組可見線粒體明顯腫脹，線粒體嵴部分?jǐn)嗔?，而丹參飲預(yù)處理I/R組、環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組線粒體超微結(jié)構(gòu)較I/R模型組明顯好轉(zhuǎn)，線粒體腫脹較I/R模型組減輕。詳見圖3。

圖3 各組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)(20 000×)

2.4 丹參飲預(yù)處理對(duì)I/R大鼠心肌線粒體mPTP的影響 在線粒體混懸液中加入CaCl2后，I/R模型組較空白對(duì)照組的心肌線粒體腫脹，吸光度下降迅速(P<0.05)，說明mPTP開放迅速；與I/R模型組相比，環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組和丹參飲預(yù)處理I/R組心肌線粒體的吸光度下降幅度均有明顯改善(P<0.05)，但丹參飲預(yù)處理I/R組與環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖4。

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與I/R模型組比較，#P<0.05

3 討 論

《中國心血管病報(bào)告2013》顯示：我國目前約有250萬心肌梗死病人；每年約有29.52萬人次因急性心肌梗死住院，隨著我國人口老齡化，個(gè)人飲食問題等危險(xiǎn)因素的增多，心肌梗死發(fā)生率呈逐漸增高的趨勢，已經(jīng)成為危害人民健康的重大公共衛(wèi)生問題。長時(shí)間急性冠狀動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致心肌梗死，盡管及時(shí)開通閉塞的冠狀動(dòng)脈可以挽救缺血的心肌，但是再灌注可以導(dǎo)致梗死面積和細(xì)胞凋亡的增加，這一現(xiàn)象稱為再灌注損傷[3]?，F(xiàn)應(yīng)對(duì)MIRI的方法主要包括缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)和缺血后適應(yīng)(POC)，但臨床應(yīng)用IPC或POC均涉及創(chuàng)傷性操作，顯著增加機(jī)械性破壞血管床的風(fēng)險(xiǎn)[4]。藥物預(yù)處理是指用藥物模擬缺血預(yù)適應(yīng)中的保護(hù)因素而產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)效應(yīng)。目前尚無令人滿意的專門用于預(yù)防MIRI的藥物，一些藥物還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段[5-6]。

心肌梗死屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“真心痛”的范疇，古有“朝發(fā)夕死，夕發(fā)朝死”的記載，屬于心臟科危重急癥之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心肌梗死是由于多種因素，導(dǎo)致心脈痹阻，冠狀動(dòng)脈阻塞，氣血運(yùn)行不暢，造成心肌缺血壞死；當(dāng)溶栓或者冠狀動(dòng)脈介入血管再通時(shí)，微小血栓、細(xì)小的粥樣硬化斑塊等隨著開通血管的血流阻塞遠(yuǎn)端冠狀動(dòng)脈血管，致再灌注后的冠狀動(dòng)脈微血管循環(huán)障礙，類似于中醫(yī)的瘀血內(nèi)結(jié)，絡(luò)氣運(yùn)行受阻，心絡(luò)瘀塞，造成MIRI[7-8]；另外，在心肌梗死再灌注復(fù)流初期，冠狀動(dòng)脈血流速度突然加快易致水液潴留，在心肌細(xì)胞內(nèi)形成類似“血瘀”的表現(xiàn)，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)血流變緩，甚至造成無灌注現(xiàn)象[9]，導(dǎo)致MIRI，因此可以認(rèn)為“瘀血”貫穿MIRI始終。

丹參飲是用于治療冠心病-胸痹心痛心血瘀阻證的經(jīng)典方劑，源自清代的《時(shí)方歌括》，由丹參、砂仁、檀香組成，具有活血化瘀的功效。方中丹參味苦，性微寒，入心、肝經(jīng)，具有活血、行氣、止痛的功效。古有“一味丹參，功同四物”的說法：補(bǔ)血生血，功過歸地；調(diào)血斂血，力堪芍藥；逐瘀生新，性倍川芎。砂仁、檀香作為佐使藥物溫中行氣止痛，與丹參共奏活血化瘀、行氣止痛之效。此三味，藥性味平和，氣血雙調(diào)，重在化瘀，使瘀化暢則痛自止[10]。丹參飲的功效、主治與MIRI的主要治療原則正好相符。所以本研究預(yù)觀察丹參飲對(duì)MIRI的影響。

本研究采用大鼠前降支結(jié)扎復(fù)流的MIRI模型，I/R模型組顯示心肌梗死范圍為(44±3)%，使用丹參飲預(yù)處理1周的I/R大鼠，心肌梗死面積為(28±4)%，較I/R模型組明顯縮小(P<0.05)，說明丹參飲預(yù)處理可以縮小心肌缺血再灌注損傷的心肌梗死面積，具有心肌保護(hù)作用。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于MIRI的病理機(jī)制尚不完全明確。近年來，心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙在MIRI病理機(jī)制中所起的重要作用引起了大家的關(guān)注。越來越多的證據(jù)顯示：mPTP的開放是I/R時(shí)引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死或凋亡的關(guān)鍵因素。mPTP在心肌缺血階段保持關(guān)閉，而在再灌注早期，心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧聚集，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，氧化應(yīng)激等使mPTP開放，引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，并釋放細(xì)胞色素C，消耗三磷酸腺苷(ATP)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使心肌細(xì)胞凋亡和心肌壞死[11]。有研究顯示：I/R早期mPTP開放決定了最終梗死面積的50%，是MIRI的關(guān)鍵[12]。因此，在I/R早期，使用藥物性拮抗劑或者基因消融抑制線粒體mPTP開放可以有效地預(yù)防MIRI，減少心肌梗死范圍[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)：透射電鏡下觀察，與空白對(duì)照組相比，I/R模型組大鼠心肌線粒體腫脹，而環(huán)孢菌素預(yù)處理I/R組和丹參飲預(yù)處理I/R組大鼠線粒體腫脹較I/R模型組減輕。大鼠心肌線粒體在Ca2+的誘導(dǎo)下，空白對(duì)照組線粒體的吸光度值下降遲緩，而I/R模型組線粒體吸光度值下降迅速，而丹參飲與mPTP抑制劑環(huán)孢菌素具有延緩其吸光度值下降的作用。說明丹參飲具有減少I/R心肌線粒體腫脹，抑制mPTP開放的作用。

行氣活血中藥復(fù)方丹參飲具有改善心肌缺血/再灌注損傷的作用，其作用機(jī)制可能與抑制心肌mPTP開放，減少心肌線粒體腫脹相關(guān)。