羊水HPV感染檢測方法及臨床意義的研究進(jìn)展

李 桐，宋金維，王建東※

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100010； 2.北京市西城婦幼保健院婦產(chǎn)科，北京 100054)

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一種嗜皮膚黏膜的DNA病毒，最常見的感染部位為生殖器黏膜和皮膚，除此之外還能造成呼吸道黏膜感染，如口咽癌、喉癌、呼吸道乳頭狀瘤等[1]。HPV亞型眾多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過100種亞型。根據(jù)不同亞型、致病力和致病類型將HPV分為高危型和低危型。高危型HPV多導(dǎo)致宮頸癌、陰道癌，低危型HPV多導(dǎo)致各種皮膚疣、生殖器疣、呼吸道乳頭狀瘤等。既往HPV的母嬰傳播途徑局限為嬰兒經(jīng)產(chǎn)道時將含HPV的宮頸分泌物吸入咽部而造成咽部黏膜感染。然而臨床中發(fā)現(xiàn)剖宮產(chǎn)分娩的新生兒也會感染HPV，由此得出HPV的母嬰傳播不僅僅是經(jīng)陰道感染，還有宮內(nèi)感染。妊娠期母體免疫力降低，易感染HPV，可能導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局并威脅新生兒健康。因此，妊娠期HPV感染的母嬰傳播途徑是非常具有研究意義的。有研究在羊水中檢測到HPV DNA，且3例羊水HPV陽性病例中有1例新生兒咽部分泌物HPV陽性[2]。但該研究樣本量較少，難以將羊水HPV陽性與新生兒咽部分泌物陽性之間的關(guān)系以百分比呈現(xiàn)。但羊水中HPV的發(fā)現(xiàn)確實是HPV宮內(nèi)感染的重要依據(jù)，也是研究者將目光轉(zhuǎn)移至宮內(nèi)感染的轉(zhuǎn)折點。但HPV感染羊水的機(jī)制、羊水HPV的檢測方法以及HPV感染對母嬰的危害需要進(jìn)一步明確。

1 羊水中HPV感染的機(jī)制

研究顯示妊娠期HPV感染率明顯高于非孕期，其原因大致可以從三個方面考慮：①妊娠期雌、孕激素水平升高致母體免疫力下降，同時母體為避免排斥胎兒呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)，使母體易受細(xì)菌及病毒的侵害[3]。②妊娠期婦女盆腔血流豐富，陰道分泌物增多，局部環(huán)境潮濕適宜HPV生長、增殖[4-5]，③雌、孕激素在感染HPV的組織中形成復(fù)合物，與孕酮應(yīng)答元件結(jié)合，造成妊娠期HPV感染風(fēng)險增高[6]。由此，妊娠期HPV易感性明顯高于非妊娠期，妊娠期HPV易感性的增加將直接增加胎兒HPV感染率?，F(xiàn)已有部分學(xué)者在羊水中檢測到HPV DNA，但是HPV感染羊水的機(jī)制有待研究。部分研究者認(rèn)為HPV首先感染胎盤，進(jìn)一步進(jìn)入羊水[7]。大部分研究者能在胎盤中檢測出HPV，盡管胎盤屏障有一定的阻隔作用，但不能阻止病毒傳播。由此認(rèn)為HPV宮內(nèi)感染途徑主要是血-胎盤途徑。鄧東銳和聞良珍[8]研究認(rèn)為HPV的母嬰傳播途徑除產(chǎn)道外還有血-胎盤途徑，胎盤HPV傳播率為60%，HPV入血，經(jīng)血液至胎盤，再經(jīng)胎盤至羊水，胎兒吞咽羊水，造成咽部黏膜感染。然而HPV進(jìn)入羊水并非一條途徑，丁鋒等[9]研究認(rèn)為HPV可通過宮頸上行感染或經(jīng)血液感染胎盤從而羊水HPV陽性，此外HPV還可經(jīng)宮頸直接感染羊水。目前HPV進(jìn)入羊水的途徑聚焦于血-胎盤途徑和上行感染，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但是通過羊水中HPV的檢測至少肯定了宮內(nèi)感染是HPV的傳播途徑之一。羊水中HPV的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制研究為進(jìn)一步HPV宮內(nèi)感染的研究奠定了基礎(chǔ)。

2 羊水中HPV感染的檢測方法

大多數(shù)研究中HPV DNA的檢測是通過核酸雜交和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)完成的[10]。最初美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的HPV檢測方法是雜交捕獲2代(hybrid capture 2，HC2)，HC2通過免疫技術(shù)、雜交技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)定性檢測HPV，其原理為溶解細(xì)胞后使核酸變性釋放出單鏈DNA，制作RNA探針與HPV DNA雜交形成DNA-RNA復(fù)合物與攜帶堿性磷酸酶的二抗結(jié)合，由堿性磷酸酶催化底物發(fā)光[11]。但HC2為定性檢測方法無法對HPV分型，因此在HC2的基礎(chǔ)上改進(jìn)檢測方法，將帶有生物素標(biāo)記的引物(GP5+/ GP6+)(bio-GPbt5/6)經(jīng)PCR技術(shù)合成針對不同HPV亞型的探針，多種探針與樣本進(jìn)行反向點雜交從而達(dá)到檢測目的[9]。丁鋒等[9]研究中共合成了HPV6、11、16、18四種探針，分別對母血、臍帶血、胎盤母體面、羊水及宮頸分泌物5種樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其HPV陽性率分別為37.0%、37.0%、40.7%、61.11%、50.0%，各樣品間檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.1)。鄧東銳等[12]研究中將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳篩選出陽性標(biāo)本，再結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)將陽性標(biāo)本進(jìn)行酶切，可根據(jù)片段大小判斷HPV亞型。還有學(xué)者設(shè)計出含高危型HPV L1/E6/E7基因的引物和探針，經(jīng)過PCR擴(kuò)增對靶DNA進(jìn)行13種HPV亞型檢測(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，設(shè)置基線和閾值，將臨界值<37作為陽性標(biāo)準(zhǔn)[1]。目前HPV-DNA檢測敏感性及特異性較高的檢測方法是Abbott檢測，即用GP5+/6+引物對HPV L1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，與特異性探針進(jìn)行雜交，通過熒光信號檢測多種HPV亞型[13-16]。不同學(xué)者對HPV DNA的檢測方法略有不同，但均是以PCR技術(shù)和核酸雜交技術(shù)為核心，向簡單、精確、多HPV亞型測定的方向發(fā)展。

雖然已經(jīng)在羊水中發(fā)現(xiàn)HPV，但是關(guān)于羊水中檢測HPV的研究較少，樣本量也不足，因此不同研究可能出現(xiàn)截然相反的結(jié)果。Syrj?nen等[17]研究顯示羊水中、胎膜、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及臍血中均能檢測到HPV DNA，以HPV6和11型為主。母親為HPV感染者，嬰兒HPV感染率為20%，嬰兒主要為黏膜感染，其中口腔黏膜及生殖器黏膜持續(xù)感染率為10%和2%。有研究顯示孕婦宮頸分泌物、外周血和羊水HPV DNA檢出率分別為35.51%(49/138)、51.11%(12/23)和25.00%(3/12)，羊水中HPV的檢出率明顯低于宮頸分泌物[12]。Lmm等[18]研究發(fā)現(xiàn)妊娠期宮頸HPV檢出率為17.5%，羊水中HPV檢出率為5.7%，羊水HPV檢出率明顯低于母體宮頸分泌物。Worda等[19]未在羊水及臍帶血中檢測到HPV DNA，僅在胎盤中檢測到HPV DNA，其檢出率為14%(8/56)。Ruffin等[20]對142名孕婦進(jìn)行羊水穿刺，以PGMY09/11 L1和GP5+/GP6+為引物檢測HPV，均未檢測出HPV DNA，認(rèn)為若HPV可以輕易穿過胎盤，那么羊水中總會有一些HPV DNA存在，而142例樣本中均未檢測出HPV，由此認(rèn)為HPV不能通過胎盤。目前羊水中HPV的研究結(jié)果差異較大，部分學(xué)者能在羊水中檢測到HPV，但是羊水HPV的檢出率明顯低于母體宮頸分泌物。

3 HPV感染對妊娠結(jié)局的影響

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為妊娠期感染HPV將增加流產(chǎn)、胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒生長受限等不良妊娠結(jié)局[21-23]。其作用機(jī)制說法不一，主要為HPV感染破壞合體滋養(yǎng)細(xì)胞功能增加流產(chǎn)、早產(chǎn)率，HPV感染增加各種妊娠期陰道炎的概率從而增加胎膜早破率。也有學(xué)者認(rèn)為HPV作用于蛻膜，促進(jìn)釋放花生四烯酸并合成前列腺素誘發(fā)宮縮，誘發(fā)早產(chǎn)[24]。HPV刺激胎膜趨化中性粒細(xì)胞，激活多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生蛋白水解酶將降解胎膜并軟化宮頸，誘發(fā)胎膜早破、增加早產(chǎn)風(fēng)險[24]。還有少部分學(xué)者認(rèn)為妊娠期HPV感染不會增加不良妊娠結(jié)局發(fā)生率[25-26]。

Lmm等[18]在滋養(yǎng)細(xì)胞、胎盤絨毛間充質(zhì)細(xì)胞和部分子宮內(nèi)膜中檢測出HPV DNA。有研究發(fā)現(xiàn)羊水HPV感染將增加細(xì)菌性陰道病和沙眼衣原體感染率，HPV以合體滋養(yǎng)細(xì)胞為攻擊目標(biāo)，破壞合體滋養(yǎng)細(xì)胞功能，增加流產(chǎn)、早產(chǎn)及胎膜早破率[27-29]。周靜等[29]研究發(fā)現(xiàn)HPV感染組胎膜早破的發(fā)生率高于未感染組(P<0.05)，而不同亞型的HPV對于胎膜早破的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HPV可以直接侵犯胎膜細(xì)胞，也可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)誘發(fā)其他細(xì)菌感染，增加胎膜早破率。Ambühl等[30]研究發(fā)現(xiàn)宮頸HPV陽性樣本中自發(fā)流產(chǎn)率為24.5%，早產(chǎn)率為47%，明顯高于正常妊娠組。張靜等[31]研究中應(yīng)用二元Logistic回歸分析顯示HPV感染是早產(chǎn)及胎膜早破的危險因素(OR=3.323,95%CI2.192～5.036)。蔡際[24]研究中設(shè)置觀察組(HPV陽性的孕婦)100例，對照組(HPV陰性孕婦)120例，觀察組早產(chǎn)、胎兒窘迫、新生兒窒息、新生兒HPV感染率分別為7%、15%、16%、35%，對照組分別為1%、3%、4%、5%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，由此可見妊娠期HPV感染會增加早產(chǎn)、胎兒窘迫、新生兒窒息、新生兒HPV感染率。

但也有研究顯示羊水HPV感染不會增加流產(chǎn)、胎兒畸形、胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒生長受限等不良妊娠結(jié)局概率，羊水中HPV陽性對妊娠結(jié)局及新生兒影響不大[32]。Naresh和Simhan[27]對13例胎膜早破孕婦進(jìn)行羊水穿刺，檢測羊水中單純皰疹病毒1/2、HPV、巨細(xì)胞病毒等多種病毒及細(xì)菌DNA/RNA發(fā)現(xiàn)羊水樣本中各種病毒均為陰性，而細(xì)菌呈陽性。因此認(rèn)為病毒不是導(dǎo)致胎膜早破的因素。Nimrodi等[33]研究顯示HPV陽性組(n=201)早產(chǎn)率為7%，HPV陰性組(n=11 261)為8.5%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HPV陽性組宮頸機(jī)能不全率為1.5%，HPV陰性組為0.5%，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此認(rèn)為HPV感染不增加不良妊娠結(jié)局發(fā)生率。

4 HPV感染對胎兒的影響

有研究認(rèn)為孕早期HPV感染生殖細(xì)胞有可能造成遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定、染色體異常，從而導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒畸形及胎兒生長受限，可能引起新生兒呼吸道乳頭瘤及生殖道尖銳濕疣等疾病。而呼吸道乳頭瘤是一種多發(fā)、易復(fù)發(fā)、不易治愈的疾病，多表現(xiàn)為咽部菜花樣贅生物、聲音嘶啞，嚴(yán)重時呼吸困難[3]。因此，妊娠期HPV的篩查對于嬰兒HPV相關(guān)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療意義重大。但也有研究發(fā)現(xiàn)雖然妊娠期HPV感染率高，但新生兒呼吸道乳頭瘤、結(jié)膜乳頭瘤等發(fā)生率并不高，其原因可能為胎兒、新生兒體內(nèi)存在HPV抗體。母體感染HPV后血液中會產(chǎn)生HPV抗體IgG,HPV抗體IgG可以通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)抵抗HPV，胎兒36周后胸腺T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟，可通過自身細(xì)胞免疫抵抗HPV。此外，嬰兒可通過母乳獲取IgA抵抗病毒感染[9]。鄭曉霞等[1]研究認(rèn)為HPV感染不增加新生兒呼吸窘迫綜合征、胎兒生長受限等發(fā)生率，母體感染HPV新生兒HPV陽性率為68.8%，雖然新生兒感染率較高，但嬰兒HPV轉(zhuǎn)歸較好，產(chǎn)后6個月嬰兒HPV陽性率僅為32.8%，產(chǎn)后1年嬰兒HPV陽性率為5.4%，產(chǎn)后2年轉(zhuǎn)陰率為100%。雖然新生兒呼吸道乳頭狀瘤難治愈，易復(fù)發(fā)，需反復(fù)手術(shù)治療，然而嬰兒感染HPV后轉(zhuǎn)陰率極高，因此臨床上對于妊娠期HPV陽性無需干預(yù)。但HPV感染可能增加不良妊娠結(jié)局發(fā)生率，不良妊娠結(jié)局直接影響新生兒健康，因此判斷HPV感染對新生兒的影響要從多個角度綜合考慮。

5 分娩方式的選擇

盡管目前認(rèn)為HPV存在宮內(nèi)感染途徑，但經(jīng)陰道分娩使HPV感染率大大增加。并且大部分研究者認(rèn)為HPV感染能引起新生兒呼吸道乳頭瘤及生殖道尖銳濕疣，呼吸道乳頭瘤會導(dǎo)致新生兒聲音嘶啞、呼吸困難，且咽部黏膜菜花樣的贅生物難以治愈、易復(fù)發(fā)。目前對于HPV陽性的孕婦是否應(yīng)避免經(jīng)陰道分娩仍存在爭議，Chatzistamatiou等[34]研究發(fā)現(xiàn)剖宮產(chǎn)HPV傳播率為14.9%，明顯低于引導(dǎo)分娩的28.2%，剖宮產(chǎn)能減少46%圍生期HPV傳播風(fēng)險，但是不能阻止HPV傳播，剖宮產(chǎn)HPV的傳播率大約為15%。Mammas等[35]應(yīng)用PCR技術(shù)對190名兒童口咽部HPV感染情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)HPV感染率為8.4%，陰道分娩與剖宮產(chǎn)無差異。于松等[36]研究認(rèn)為HPV陽性孕婦經(jīng)陰道分娩和剖宮產(chǎn)新生兒HPV感染率分別為64.1%(41/64)和43.2%(16/37)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雖然剖宮產(chǎn)能降低新生兒HPV感染率，但不能阻止HPV傳播。目前大部分學(xué)者認(rèn)為HPV陽性不應(yīng)成為剖宮產(chǎn)指征[21，32，37-38]：①剖宮產(chǎn)雖能降低新生兒HPV感染風(fēng)險，但由于HPV存在宮內(nèi)感染，因此不能阻止HPV的母嬰傳播。②新生兒感染HPV固然有呼吸道乳頭瘤的風(fēng)險，然而發(fā)病率不高，但多數(shù)感染能在1年內(nèi)轉(zhuǎn)陰。③剖宮產(chǎn)較自然分娩存在很大風(fēng)險，如手術(shù)本身存在風(fēng)險以及再次妊娠有瘢痕子宮破裂等風(fēng)險，其風(fēng)險性不低于HPV感染。還有研究認(rèn)為新生兒HPV感染率為68.8%，新生兒經(jīng)陰道分娩和剖宮產(chǎn)HPV感染率無差異[1]。部分研究者認(rèn)為剖宮產(chǎn)能降低HPV傳播率，但不能完全阻止其傳播[1]。且嬰兒2年內(nèi)HPV轉(zhuǎn)陰率極高，剖宮產(chǎn)術(shù)本身具有一定風(fēng)險，再次妊娠也有子宮破裂等風(fēng)險，因此HPV感染不作為剖宮產(chǎn)指征。

6 小 結(jié)

隨著羊水中HPV DNA檢測研究的深入，已證明HPV不僅通過產(chǎn)道感染嬰兒，還能通過宮內(nèi)感染影響胎兒健康。HPV感染對胎兒的主要危害在于胎兒吞咽羊水中HPV使咽部黏膜感染直接導(dǎo)致新生兒呼吸道乳頭狀瘤，不良妊娠結(jié)局對胎兒的影響以及嬰兒各種皮膚疣、生殖道疣感染等。雖然羊水中能檢測出HPV DNA，但欠缺HPV的分型與定量研究，HPV感染與不良妊娠結(jié)局、新生兒疾病等關(guān)系尚不十分明確。但目前研究顯示HPV感染可能增加不良妊娠結(jié)局和胎兒疾病發(fā)生率。考慮目前研究數(shù)目有限，樣本量較小，不同學(xué)者研究結(jié)論差異較大，未將HPV感染列為剖宮產(chǎn)指征，應(yīng)繼續(xù)深入大樣本的研究，以剖析圍生期HPV感染的發(fā)生、發(fā)展、傳播途徑及不良后果。