3D打印脫細(xì)胞外基質(zhì)支架修復(fù)軟骨缺損的研究進(jìn)展

王議峰，李松軍

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院骨一科，廣東 珠海 519100)

關(guān)節(jié)軟骨缺乏營養(yǎng)供應(yīng)，損傷后自我修復(fù)能力差[1]，從而導(dǎo)致長期的關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，甚至關(guān)節(jié)廢用，給患者帶來極大的痛苦和不便。傳統(tǒng)的軟骨修復(fù)方法，如微骨折術(shù)、軟骨下鉆孔術(shù)、骨膜移植等，修復(fù)的是纖維軟骨，在組織學(xué)上纖維軟骨與周圍正常軟骨不同[2]，導(dǎo)致療效不佳。近年來，對制備組織工程支架所需的3D 打印材料——生物油墨研究較多，利用該材料制備的3D支架與軟骨缺損部位解剖外形吻合，同時具有細(xì)胞黏附、增殖所需三維結(jié)構(gòu)以及支架材料所必需的機(jī)械強(qiáng)度，這給軟骨損傷及缺損的修復(fù)帶來了希望。目前，3D打印材料種類繁多，選擇合適的材料作為生物油墨是3D生物打印成功的關(guān)鍵一步[3]。迄今為止，以天然生物聚合物為基礎(chǔ)的水凝膠，如海藻酸鹽[4]、明膠[4]、膠原蛋白[5]、纖維蛋白[5]、透明質(zhì)酸[6]和殼聚糖[7]等，已被證明具有生物油墨的一些基本特性。這些生物油墨不僅可以作為3D支架的基礎(chǔ)，還可以維持和促進(jìn)細(xì)胞的活性。盡管如此，在固有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中模仿錯綜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)仍然存在困難[8-9]。此外，每個組織都有固有的ECM組成結(jié)構(gòu)，使得理想的ECM擬態(tài)的構(gòu)建可能超出任何組織工程技術(shù)的制造能力[10]。脫細(xì)胞外基質(zhì)(decellularized extracellular matrix, DECM)被認(rèn)為是最有前途的替代材料之一?，F(xiàn)總結(jié)DECM支架修復(fù)軟骨缺損的研究現(xiàn)狀，并總結(jié)在研究和應(yīng)用中所遇到的問題及發(fā)展方向。

1 DECM支架修復(fù)軟骨缺損的機(jī)制

1.1促進(jìn)軟骨細(xì)胞黏附增殖 DECM具有良好的組織相容性，細(xì)胞可通過自身表面抗原與其結(jié)合，從而提高了細(xì)胞的黏附性。Kang等[11]運用人關(guān)節(jié)軟骨DECM構(gòu)建3D支架，這種支架可以支持間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)的細(xì)胞黏附與增殖。而目前有研究證實，與純聚合物相比，DECM的天然蛋白質(zhì)或多糖與合成聚合物的組合使磷酸化黏著斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, pFAK)表達(dá)增加，從而增強(qiáng)細(xì)胞黏附和增殖[12]。其主要機(jī)制為:pFAK通常用作細(xì)胞/材料相互作用的重要生物標(biāo)志物，它通過細(xì)胞信號通路對細(xì)胞周期、黏附增殖進(jìn)行調(diào)控。細(xì)胞信號通路常在細(xì)胞-ECM相互作用下被觸發(fā)，使細(xì)胞生長因子上調(diào)，然后通過在黏著斑點處直接結(jié)合整合素β1的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域來激活FAK。研究發(fā)現(xiàn)FAK是整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì)，這種整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附促進(jìn)了FAK的自身磷酸化[13]。之后，pFAK調(diào)節(jié)局灶性接觸，形成細(xì)胞擴(kuò)散和誘導(dǎo)細(xì)胞運動所必需的信號通路[14]。據(jù)報道，pFAK還可進(jìn)一步激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖[15]。鑒曉東等[16]運用羥基丁酸-羥基辛酸共聚體(poly hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate,PHBHOx)/DECM構(gòu)建組織工程支架，并進(jìn)行細(xì)胞-支架培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行細(xì)胞黏附率測定，發(fā)現(xiàn)實驗組支架的細(xì)胞黏附率及細(xì)胞增殖數(shù)量明顯高于對照組，并且隨著PHBHOx與DECM復(fù)合比例的變化，支架的細(xì)胞黏附率及細(xì)胞增殖數(shù)量也隨之變化。Shakouri-Motlagh等[17]發(fā)現(xiàn)，與在TCP上擴(kuò)增的MSC相比，在DECM上擴(kuò)增的MSC數(shù)量顯著增加。DECM因自身結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附增殖，與其他支架材料構(gòu)建的復(fù)合物增強(qiáng)了細(xì)胞增殖與黏附的效果，這為通過組織工程支架搭載多能分化細(xì)胞進(jìn)行軟骨缺損修復(fù)提供了理論基礎(chǔ)。

1.2促進(jìn)干細(xì)胞定向分化 能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化是理想的組織工程支架的基本條件之一。近年來，DECM作為生物油墨構(gòu)建3D支架，受到廣泛關(guān)注。DECM與ECM結(jié)構(gòu)及組成相似，而組織器官的機(jī)械強(qiáng)度部分依賴于ECM,因此，不同強(qiáng)度對ECM的機(jī)械刺激，可影響細(xì)胞行為。研究顯示，MSC可以識別基質(zhì)的硬度，并根據(jù)基質(zhì)硬度分化成不同的譜系[18]。同時，ECM可以下調(diào)可溶性因子的活性。其蛋白多糖可以與骨形態(tài)發(fā)生蛋白的抑制劑腱蛋白結(jié)合，抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路[19]。此外，ECM蛋白本身也可以通過與細(xì)胞黏附分子如整合素[13]的相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號，調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、形態(tài)發(fā)生遷移和分化等多種細(xì)胞功能[15,20]。

干細(xì)胞是組織工程和再生醫(yī)學(xué)中很有前景的細(xì)胞來源。在干細(xì)胞分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受細(xì)胞外微環(huán)境信號(如可溶性因子和ECM)的調(diào)控，研究者可以根據(jù)DECM促進(jìn)干細(xì)胞定向分化的特性進(jìn)行研究。Jang等[21]通過3D打印技術(shù)構(gòu)建DECM補(bǔ)片進(jìn)行心臟修復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)DECM補(bǔ)片能夠促進(jìn)其中的心臟干細(xì)胞/MSC定向分化為新生血管以及促進(jìn)心肌重塑。此外，軟骨修復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，軟骨DECM能夠為細(xì)胞提供三維環(huán)境，適合于MSC的附著、增殖和軟骨分化[22-23]。Mao等[24]在對DECM支架的實驗研究中也發(fā)現(xiàn)，DECM能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)MSC定向分化為軟骨細(xì)胞。同時，他們對于不同組織的ECM進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示，來自軟骨細(xì)胞的ECM促進(jìn)了MSCs的軟骨分化，來自成骨細(xì)胞的ECM促進(jìn)了MSCs的成骨分化。這些研究表明，DECM能夠促進(jìn)干細(xì)胞分化，但不同組織來源的DECM在組成上具有特異性，因而可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向不同組織和功能的細(xì)胞分化。

1.3低異物反應(yīng) 異物反應(yīng)是支架材料修復(fù)軟骨缺損的影響因素。支架材料植入機(jī)體后，其表面抗原與機(jī)體抗體結(jié)合，促進(jìn)生長因子、趨化因子及細(xì)胞因子等聚集，募集固有免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)到損傷部位，形成肉芽腫，并逐漸形成瘢痕組織，最終完成損傷修復(fù)[25]。異物反應(yīng)不可避免，但過度的異物反應(yīng)會延遲組織愈合，增加瘢痕形成。特別是對于軟骨組織，過度異物反應(yīng)，瘢痕組織增加，不利于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，并影響關(guān)節(jié)功能。支架材料植入體內(nèi)后引起的炎癥反應(yīng)與植入材料的類型有關(guān)[25]，因此有關(guān)支架材料的研究希望改變或控制上述因素，從而降低異物反應(yīng)，達(dá)到組織修復(fù)的目的。DECM屬于天然生物油墨，在此方面優(yōu)勢明顯。研究顯示，組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理后，移除了可能引起機(jī)體炎癥反應(yīng)或免疫介導(dǎo)的植入物排斥反應(yīng)的潛在抗原[20]。這在臨床試驗中也得到證實，有研究者成功地將一個脫細(xì)胞的人供體氣管移植入1例患有終末期支氣管軟化癥的30歲女性體內(nèi)。該患者未接受免疫抑制治療，移植3個月后無異物反應(yīng)[26]。

2 DECM的生物力學(xué)特性

一個好的軟骨支架，不僅能為細(xì)胞提供良好生長環(huán)境，還要具備良好的生物力學(xué)性能。然而DECM材料作為3D打印制備組織工程支架還有很多不足，主要是打印出來DECM支架通常沒有足夠的機(jī)械性能[27]。有研究者用DECM支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，對脫細(xì)胞基質(zhì)支架進(jìn)行生物力學(xué)檢測，結(jié)果顯示其剛度明顯小于正常軟骨組織[28]。另一研究從脂肪組織提取DECM打印組織工程支架，并在體內(nèi)成功進(jìn)行軟組織修復(fù)。但是DECM的溶解使其失去了原有的結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度[29]。因此，為了提高油墨的印刷性和組織功能，需要一種方法來調(diào)整DECM生物油墨的機(jī)械性能，目前主要通過改善DECM支架制備技術(shù)和支架材料的構(gòu)成提高其機(jī)械性能。

2.1聚合物/DECM支架 用于構(gòu)建DECM復(fù)合支架的聚合物主要分為糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)、絲素蛋白等天然高分子聚合物及聚己內(nèi)酯(polycaprolactone, PCL)、聚乙烯醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)、PHBHOx等非天然高分子聚合物，它們具有良好的生物相容性和良好的機(jī)械性能，可彌補(bǔ)DECM支架機(jī)械性能不足的缺陷。Beachley等[30]用硫酸軟骨素-N-羥基琥珀酰亞氨基琥珀酸酯對GAG進(jìn)行修飾后制備GAGs/GAG支架，其機(jī)械性能明顯增加。用絲素蛋白結(jié)合DECM制備的復(fù)合取向支架也顯示出良好的力學(xué)性能，且成分與天然軟骨相似，可以滿足天然軟骨對支架結(jié)構(gòu)的需求[31-32]。同樣，PHBHOx[16]、PCL[33]、聚乙烯醇[34]、PLGA[35]與DECM制備的復(fù)合支架不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖，同時機(jī)械性能較單純的DECM支架明顯提高，且隨著復(fù)合支架中高分子聚合物比例增加，機(jī)械性能也明顯提高。但有研究顯示，非天然高分子聚合物(如PCL)降解周期長(> 2年)，可能對機(jī)體造成不良影響[33]。

2.2MSC/DECM支架 MSC是當(dāng)前組織工程領(lǐng)域的研究熱點，在軟骨缺損修復(fù)方面，常用的干細(xì)胞為骨髓來源MSC和脂肪來源MSC。其主要優(yōu)點為：①來源廣泛，MSC存在于骨髓、脂肪組織、胎盤組織、牙髓、外周血及滑膜等組織中；②分離簡單、培養(yǎng)成功率高；③具有成骨、成軟骨、成脂肪細(xì)胞等多項分化潛能；④能夠分泌多種細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)，具有免疫抑制特性。因此，MSC在軟骨修復(fù)方面潛力巨大。有研究證實[11,36]，軟骨DECM支架可以促進(jìn)骨髓來源MSC或脂肪來源MSC分化為透明軟骨，且機(jī)械性能明顯提高。

2.3DECM支架制備技術(shù)改進(jìn) 當(dāng)前3D打印技術(shù)(如噴墨打印)構(gòu)建的DECM支架不能滿足軟骨所需的生物力學(xué)性能，因此研究者對打印技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。下面列舉兩種支架制備技術(shù)。

2.3.1基于數(shù)字光處理的快速3D生物打印 數(shù)字光處理快速3D打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較少。Ma等[37]開發(fā)出數(shù)字光處理的快速3D生物打印方法，并運用于肝臟DECM支架的構(gòu)建，結(jié)果顯示，肝臟DECM的支架不僅支持細(xì)胞活力，還提供穩(wěn)定的生理學(xué)相關(guān)的機(jī)械環(huán)境。其主要優(yōu)點為：①實現(xiàn)了生理相關(guān)幾何形狀的靈活設(shè)計以及對支架機(jī)械性能的精確控制；②通過改變曝光時間，可以在不改變支架組分的情況下易于控制剛度變化，從而消除由材料濃度或化學(xué)組成不同對細(xì)胞行為產(chǎn)生的影響。這種3D打印技術(shù)在組織工程支架制造技術(shù)中顯示出了一定的優(yōu)勢，但該技術(shù)在軟骨修復(fù)方面的研究還未見報道。

2.3.2冷凍干燥技術(shù)/3D打印 冷凍干燥技術(shù)和3D打印技術(shù)結(jié)合，能夠精確構(gòu)建宏觀結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)相結(jié)合的組織工程支架，從而提高生物力學(xué)性能。Xu等[38]通過定向冷凍技術(shù)制備的DECM支架，不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞生長和軟骨再生，還具有定向顯微結(jié)構(gòu)和高力學(xué)性能。但是不同材料打印時所需參數(shù)不同，增加了打印難度與成本。

3 DECM支架材料在軟骨缺損處的固定

支架固定是組織再生的關(guān)鍵步驟，但有關(guān)支架固定的報道較少。組織工程支架在軟骨缺損處如何實現(xiàn)生物固定、功能整合，以及如何防止其在軟骨缺損處移動，都是需要解決的問題。傳統(tǒng)的方法主要為縫合固定和壓合固定，但這些方法會造成固定困難、移位、手術(shù)時間長等問題。另外，多處縫合會導(dǎo)致軟骨骨折或支架損壞，術(shù)后可能導(dǎo)致植入物降解、吸收[39]。針固定和銷釘固定已被提出替代傳統(tǒng)縫合方法[40-41]，與傳統(tǒng)縫合技術(shù)相比，它們的極限失效載荷、屈服載荷和剛度顯著提高[40]。但是，由于針固定和銷釘固定技術(shù)對支架材料的生物力學(xué)性能要求較高，因此，這種固定技術(shù)不能使力學(xué)性能較低的支架在軟骨缺損處得到有效固定。D?ner[39]提出以2-氰基丙烯酸丁酯為軟骨黏結(jié)劑，以促進(jìn)基質(zhì)植入，這種固定方式具有結(jié)合緊密、容易固定軟骨移植物的特點，同時2-氰基丙烯酸丁酯具有生物降解特性，但目前臨床上尚未推廣。也有研究表明，生物相容性膠粘劑與壓合技術(shù)相比并不能改善支架的固定[42-43]。有研究者制備了脫細(xì)胞軟骨源性基質(zhì)支架與磷酸鈣基的復(fù)合支架，脫細(xì)胞軟骨源性基質(zhì)支架可以作為骨軟骨插頭,結(jié)合插入壓合的方式,使支架復(fù)合物固定于軟骨缺損基地部，避免了不安全的或復(fù)雜的固定技術(shù)引起的周圍組織損傷[28]。隨著跨學(xué)科研究的興起，一種基于磁場力，將支架牢牢固定在植入位置的方法已經(jīng)產(chǎn)生[44-45]。該方法通過磁力達(dá)到有效的支架固定，操作簡單。但還有許多問題需要研究，如磁性材料，是否具有生物相容性、降解性，以及植入機(jī)體后的安全性問題等。

4 問題及展望

3D打印技術(shù)的發(fā)展，為軟骨缺損修復(fù)帶來了新希望，它可以根據(jù)受損部位的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計出個性化組織工程支架。同時隨著生物油墨材料的不斷發(fā)展以及制備技術(shù)的改進(jìn)，軟骨缺損修復(fù)具有巨大發(fā)展前景。脫細(xì)胞基質(zhì)材料作為生物油墨構(gòu)建軟骨支架，具備很大的潛力。它來源于自體組織，具備良好的細(xì)胞黏附、增殖及定向分化能力，同時生物安全性高，能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)在的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能重建。但DECM機(jī)械性能差，不能滿足關(guān)節(jié)軟骨所必需的機(jī)械強(qiáng)度。雖然脫細(xì)胞基質(zhì)與其他材料復(fù)合(如PLGA)構(gòu)建的支架材料機(jī)械性能提高，但還存在一些較難解決的問題，如加大了材料的硬度，其韌性就會下降。對于支架復(fù)合物，如何能夠在軟骨缺損處可靠固定以及固定方式、固定材料的選擇也是目前軟骨修復(fù)方面需要進(jìn)一步研究的課題。