Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑對(duì)骨肉瘤生長作用的研究進(jìn)展

謝曉亮 李玉梅 朱海霞 樊天佑

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒童和青少年長骨干骺端常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，以產(chǎn)生骨樣基質(zhì)為病理特征，具有高復(fù)發(fā)率、多藥耐藥性、早期易肺轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1]。以往骨肉瘤患者采用患肢手術(shù)切除治療為主，隨著以甲氨蝶呤、順鉑等為基礎(chǔ)的新輔助化學(xué)治療(以下簡稱化療)的應(yīng)用，骨肉瘤患者的5年生存率提高到60%～70%，但卻不能有效地降低總病死率和改善整體預(yù)后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者5年生存率<20%[2, 3]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路已被證實(shí)在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[4,5]。眾多研究表明，Wnt信號(hào)的異常激活和β-catenin的高表達(dá)與骨肉瘤異常組織學(xué)形態(tài)及細(xì)胞的異常增殖和分化相關(guān)，最終導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生[6～8]。同時(shí)在骨肉瘤細(xì)胞系中Wnt/β-catenin信號(hào)的多種配體、受體以及共同受體均呈高表達(dá)，而Wnt信號(hào)抑制因子WIF-1、DKKs水平卻處于低表達(dá)狀態(tài)，表明Wnt/β-catenin信號(hào)在骨肉瘤細(xì)胞中的異常激活是導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要因素[9]。因此，通過靶向抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性可能成為骨肉瘤治療的一個(gè)新策略，尋找Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑成為探索治療骨肉瘤的新熱點(diǎn)。

一、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的組成及機(jī)制

Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育中扮演重要角色，對(duì)控制骨骼發(fā)育、骨量和成骨細(xì)胞分化起關(guān)鍵作用。Wnt信號(hào)通路由細(xì)胞膜(包括膜外和膜上)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核3部分信號(hào)組成，即細(xì)胞膜外Wnt蛋白，細(xì)胞膜上特異性7次跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)和輔助性受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)，胞質(zhì)內(nèi)的散亂蛋白(Dvl)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、軸蛋白(Axin)、結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白(APC)、酪蛋白激酶Ⅰ(CK1)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子(LEF)家族及其下游靶基因，如MMPs、survivin、cyclin D和c-Myc等組成，由于經(jīng)典Wnt通路的啟動(dòng)依賴β-catenin轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，故稱為Wnt/β-catenin信號(hào)[10, 11]。

在沒有Wnt配體存在時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)大部分β-catenin與細(xì)胞膜上E-鈣黏蛋白結(jié)合，使之附著于細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白上介導(dǎo)細(xì)胞之間黏附。對(duì)于少部分游離型β-catenin則被Axin、APC、CK1和GSK-3β形成的β-catenin降解復(fù)合物通過氨基端磷酸化及U3泛素連接酶β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)蛋白(β-TRCP)識(shí)別泛素化，最終通過泛素蛋白酶體途徑降解。因此細(xì)胞內(nèi)游離的β-catenin水平低，不能轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄作用而阻止下游靶基因的表達(dá)[12]。反之，當(dāng)細(xì)胞受到Wnt信號(hào)刺激時(shí)，胞膜外配體Wnt蛋白分子同時(shí)與7次跨膜細(xì)胞的特異性受體Frezded和輔助性受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)結(jié)合，促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)Dvl蛋白的活化，活化的Dvl蛋白抑制β-catenin降解復(fù)合物中關(guān)鍵成分GSK-3β的活性，使β-catenin不被GSK-3β磷酸化，避免了泛素蛋白酶體對(duì)其識(shí)別和降解而積聚在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚到一定濃度時(shí)就開始轉(zhuǎn)向細(xì)胞核內(nèi)，并與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合導(dǎo)致下游靶基因的啟動(dòng)因子暴露而被激活表達(dá)，引起細(xì)胞的異常增殖，凋亡抵抗等作用，促進(jìn)腫瘤的形成[9]。因此，β-catenin被認(rèn)為是整條信號(hào)通路中的關(guān)鍵樞紐分子，它由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是該信號(hào)通路激活后行使其功能的重要特征[13]。

二、Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑與骨肉瘤

骨肉瘤是一種高度惡性的侵襲性疾病，雖然隨著根治性手術(shù)結(jié)合新輔助化療的應(yīng)用，患者的5年生存率有了較大的提高，但它仍然是醫(yī)學(xué)上難以攻克的難題。以往研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其機(jī)制較為復(fù)雜，通過抑制該信號(hào)通路的活性可抑制骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展[14]。目前通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路阻礙骨肉瘤的發(fā)展主要圍繞在藥物類抑制劑、酶類抑制劑、微小RNA等抑制作用的研究。

1.藥物類抑制劑：耐藥性是骨肉瘤患者治療失敗的歸因之一，尤其是多藥耐受性，尋找藥物作用新靶點(diǎn)是解決骨肉瘤藥物耐受的關(guān)鍵。盡管如此，對(duì)于骨肉瘤患者來說，藥物耐受的關(guān)鍵機(jī)制仍然沒有定論。

(1)GSK-3β藥物作用靶點(diǎn)：GSK-3β可使β-catenin 磷酸化，磷酸化位點(diǎn)為β-catenin的4個(gè)N端位點(diǎn)，這些位點(diǎn)為β-catenin磷酸化的一個(gè)標(biāo)志，將被蛋白酶體降解，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子[15]。近年來， Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)青蒿素能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞和裸鼠移植瘤的生長，其機(jī)制是通過抑制GSK-3β中絲氨酸9(Ser9)磷酸化來激活GSK-3β降解β-catenin；同時(shí)青蒿素能下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中的Dvl蛋白，解除了Dvl蛋白對(duì)由GSK-3β、APC和Axin等形成的降解復(fù)合體中的關(guān)鍵成分GSK-3β活性的抑制，使β-catenin被GSK-3β磷酸化所降解，使Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失活抑制骨肉瘤的活性。同時(shí)也有研究表明冬凌草甲素通過增加GSK3β的活性和上調(diào)dickkopf-1(Dkk-1)表達(dá)，下調(diào)了β-catenin的表達(dá)抑制143B細(xì)胞的增殖作用，相反，Dkk-1過表達(dá)或β-catenin敲低可以增強(qiáng)143B細(xì)胞中冬凌草甲素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用[17]。Chang等[18]研究表明重樓皂苷(PPI)具有抑制骨肉瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移作用，其機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的失活有關(guān)，PPI能靶向降低p-GSK-3β的表達(dá)，導(dǎo)致活性β-catenin水平下調(diào)，使通路被抑制，而加入GSK-3β特異性抑制劑CHIR99021后，PPI誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞活力抑制被消除，表明通過抑制該通路具有很好的抑瘤效果。綜上研究可見多種藥物可通過增加GSK-3β的活性，促進(jìn)β-catenin的降解并減少其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活，抑制腫瘤的生長。靶向作用GSK3β使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活可能是骨肉瘤的潛在治療靶點(diǎn)。

(2)β-catenin藥物作用靶點(diǎn)：Ma等[19]體外實(shí)驗(yàn)研究表明夾竹桃苷能抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，具有很好的抗癌作用，其作用機(jī)制是通過減少骨肉瘤細(xì)胞質(zhì)總β-catenin的表達(dá)以及減少β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)入，抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)Wnt特異性TOP/FOP熒光酶素報(bào)告基因表達(dá)量的減少也表明減弱了轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄活性，以及下調(diào)Wnt靶基因MMP2和MMP9的表達(dá)抑制細(xì)胞的遷移侵襲能力。Guo等[20]研究表明黃芩素處理的骨肉瘤細(xì)胞中β-catenin及其靶基因(包括C-myc，cyclin D1和survivin)的水平顯著下降，而β-catenin的外源性過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)黃芩素的抗增殖和抗轉(zhuǎn)移作用。在異種移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)黃芩素的治療顯著抑制移植瘤的生長，提高荷瘤鼠的生存率，抑制瘤體β-catenin的表達(dá)。Tie等[21]研究表明淫羊藿苷通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡及抑制細(xì)胞的生長，減弱TOPFlash熒光表達(dá)，腺病毒過表達(dá)β-catenin后能逆轉(zhuǎn)淫羊藿苷的抑制作用。Liu等[22]研究表明芹菜素可抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖，減少其侵襲能力，下調(diào)β-catenin的表達(dá)抑制骨肉瘤的生長。當(dāng)β-catenin過表達(dá)時(shí)抑制作用減弱，敲減β-catenin的表達(dá)時(shí)抑制作用增強(qiáng)，表明芹菜素通過作用該通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長。同時(shí)另有研究表明白藜蘆醇、烏索酸等也具有通過下調(diào)β-catenin的表達(dá)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)的活性而使骨肉瘤細(xì)胞的生長被抑制[23，24]。

以上研究表明，不同藥物具有不同的作用靶點(diǎn)，其中β-catenin的下調(diào)對(duì)通路的活性抑制具有重要的作用，通過抑制通路的不同環(huán)節(jié)使異常激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制將是骨肉瘤治療的重要策略之一。

2.酶類抑制劑:Xia等[25]研究表明環(huán)氧化酶COX-2塞來昔布通過激活GSK-3β依賴性基因的轉(zhuǎn)錄使β-catenin被磷酸化而降解，減少β-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)入而使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活，抑制MG-63細(xì)胞生長。Li等[26]研究表明TIKI2是抑制Wnt信號(hào)的蛋白酶，在骨肉瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中TIKI2低表達(dá)，TIKI2蛋白酶能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，能將成熟的Wnt蛋白去除N-末端氨基酸，Wnt蛋白隨后被寡聚化而失活。通過腺病毒轉(zhuǎn)染TIKI2恢復(fù)其表達(dá)后促進(jìn)β-catenin的磷酸化和減少細(xì)胞核β-catenin表達(dá)，抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)在荷瘤鼠實(shí)驗(yàn)中使用Wnt激活劑后能減弱TIKI2對(duì)瘤體的生長抑制作用，表明TIKI2對(duì)骨肉瘤的抑制作用是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用的。在活性酶的水平上進(jìn)行調(diào)控是一高效的方法，環(huán)氧化酶COX-2和TIKI2蛋白酶均能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的活性，對(duì)骨肉瘤的治療具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

3.微小RNA：越來越多的研究表明微小RNA(miRNA)失調(diào)和Wnt/β-catenin信號(hào)通路共同推動(dòng)癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥性。miRNA具有定向調(diào)節(jié)基因表達(dá)作用，通過對(duì)基因的修飾，一些miRNA啟動(dòng)子含有Wnt信號(hào)通路中細(xì)胞信號(hào)分子的特異性結(jié)合位點(diǎn)，能激活或抑制Wnt信號(hào)通路的各步驟。就腫瘤的發(fā)病和預(yù)后而言，miRNA可以扮演癌基因或抑癌基因的角色，而miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)且與骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，具有更優(yōu)越的應(yīng)用前景。Li等[27]研究表明miR-370作為腫瘤抑制因子，miR-370能夠靶向抑制FOXM1與β-catenin相結(jié)合形成的復(fù)合物，抑制β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，抑制轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移作用。同時(shí)另有研究表明，miR-182能靶向作用HOXA9的轉(zhuǎn)錄后修飾，下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)了人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。Yang等[28]研究發(fā)現(xiàn)miR-183具有抑癌功能，Wnt信號(hào)通路中的LRP6 mRNA 3′-UTR含有保守的miR-183結(jié)合位點(diǎn)，MiR-183通過直接靶向其3′-UTR來下調(diào)LRP6的表達(dá)使Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失活。當(dāng)LRP6過表達(dá)后具有逆轉(zhuǎn)miR-183對(duì)腫瘤抑制作用，表明miR-183 能使Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑失活，抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲作用。Zhang等[29]研究表明miR-107能夠靶向作用于Dkk-1的 3′-UTR區(qū)域，miR-107的過表達(dá)可以促進(jìn)Dkk-1的表達(dá)，而Dkk-1為競爭性結(jié)合LRP 5/6關(guān)閉了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長。綜上研究表明，miRNA通過靶向結(jié)合Wnt信號(hào)通路的不同分子，對(duì)通路相關(guān)分子進(jìn)行基于水平的修飾而影響骨肉瘤細(xì)胞的生長。

4.其他:圍繞以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而使骨肉細(xì)胞的生長受抑制，Yong等[30]研究發(fā)現(xiàn)，癌癥亮氨酸拉鏈下調(diào)因子1(LDOC1)表達(dá)增加與Wnt5a水平降低相關(guān)，降低了骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力。上調(diào)骨肉瘤LDOC1表達(dá)，減少Dvl2和Wnt5a的表達(dá)，而Dvl2和Wnt5a都是Wnt信號(hào)通路蛋白并參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，從而表明LDOC1可以通過直接/間接與Wnt信號(hào)通路相互作用調(diào)節(jié)骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。Zhang等[31]研究表明，RAS蛋白家族RASSF4在骨肉瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，RASSF4過表達(dá)顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲以及EMT過程。同時(shí)，RASSF4過表達(dá)顯著降低骨肉瘤細(xì)胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的蛋白表達(dá)，表明RASSF4是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制骨肉瘤的活性。以上研究表明，調(diào)節(jié)因子和拮抗劑在抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的同時(shí)也具有抑制骨肉瘤的活性，具有很好的應(yīng)用前景。

三、展 望

信號(hào)通路是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域較活躍的主題之一，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條研究較明確的通路，以往大量研究證明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活是導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)病的機(jī)制之一，為臨床骨肉瘤的治療提供了一個(gè)潛在的治療思路。但目前仍處于實(shí)驗(yàn)和探索階段，缺乏相關(guān)的臨床試驗(yàn)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑能夠通過調(diào)節(jié)通路信號(hào)分子而失活，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路是治療骨肉瘤很有前景的治療策略。因此，在大量實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的前期臨床試驗(yàn)研究，進(jìn)一步證明Wnt/β-catenin信號(hào)通路是治療骨肉瘤有效的靶點(diǎn)，為臨床上應(yīng)用Wnt/β-catenin信號(hào)通路治療骨肉瘤提供一個(gè)有力的依據(jù)。此外，當(dāng)前的研究多集中在單信號(hào)通路之間的抑癌作用，不同信號(hào)通路之間的交互作用需進(jìn)一步探討。也有研究表明此通路參與人體正常生理反應(yīng)，抑制該通路時(shí)是否會(huì)同時(shí)帶來其他的不良反應(yīng)需進(jìn)一步研究[13]。不同抑制劑在體外的作用效果當(dāng)在復(fù)雜的體內(nèi)生理環(huán)境下是否具有同樣的效果，需開展相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。因此，隨著相關(guān)機(jī)制不斷深入研究，人們可以從更多的角度進(jìn)行探索骨肉瘤的治療靶點(diǎn)，并獲得基于該靶點(diǎn)治療骨肉瘤的可能，將為人類戰(zhàn)勝腫瘤提供新的希望。