重組人源性膠原蛋白的制備及表征

侯增淼，李曉穎，李敏，楊金芳，楊小琳，趙金禮

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重組人源性膠原蛋白的制備及表征

侯增淼，李曉穎，李敏，楊金芳，楊小琳，趙金禮

陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司，陜西 西安 710054

為了獲得可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的重組人源性膠原蛋白，根據(jù)人I型膠原蛋白Gly-X-Y序列，優(yōu)選親水性的Gly-X-Y膠原肽段設(shè)計(jì)人源性膠原蛋白氨基酸序列及對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，利用酶切技術(shù)構(gòu)建pPIC9K-COL表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得人源性膠原蛋白畢赤酵母工程菌，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵、純化及鑒定。結(jié)果顯示，獲得表達(dá)量達(dá)4.5 g/L，純度大于95%的人源性膠原蛋白，經(jīng)氨基酸N端測(cè)序、分子量測(cè)定、氨基酸分析及膠原酶降解試驗(yàn)，確定獲得的蛋白與理論的人源性膠原蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)一致；同時(shí)膠原經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行掃描電鏡分析及細(xì)胞毒性試驗(yàn)，確定人源性膠原蛋白凍干品具有多孔纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及優(yōu)良的細(xì)胞相容性，預(yù)示其具備作為生物醫(yī)學(xué)材料的潛質(zhì)。

膠原蛋白，人源性，畢赤酵母，生物材料

膠原蛋白 (Collagen) 是體內(nèi)含量最多的一種蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的主要成分，其對(duì)維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復(fù)有重要作用[1]。在分子結(jié)構(gòu)上，每條膠原肽鏈主要由Gly-X-Y (X、Y 是Gly之外的任何氨基酸殘基) 三聯(lián)體重復(fù)構(gòu)成，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)是形成膠原纖維高級(jí)結(jié)構(gòu)所必需的，它決定了膠原蛋白優(yōu)良的生物相容性和低免疫原性，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及化妝品行業(yè)中[2-3]。

在現(xiàn)有技術(shù)中，膠原蛋白的主要來(lái)源是動(dòng)物組織提取，而隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因重組技術(shù)，通過(guò)微生物發(fā)酵法獲得重組膠原已取得巨大成果，與天然膠原蛋白相比，利用該技術(shù)生產(chǎn)的膠原蛋白解決了傳統(tǒng)提取法存在的病毒隱患缺陷，同時(shí)又顯著提高了膠原蛋白的穩(wěn)定性、親水性和生物相容性[4]。微生物發(fā)酵所用宿主菌目前主要采用大腸桿菌[5-7]和甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母[8-9]，但采用大腸桿菌表達(dá)獲得的重組膠原蛋白存在純化困難的問(wèn)題及內(nèi)毒素含量高的風(fēng)險(xiǎn)，而甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)具有目的蛋白表達(dá)量高、純化方法簡(jiǎn)單、不受內(nèi)毒素影響等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)，是膠原蛋白重組表達(dá)的優(yōu)勢(shì)宿主菌。本研究以畢赤酵母為宿主菌，構(gòu)建表達(dá)人源性膠原蛋白基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵純化獲得高純度人源性膠原蛋白，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行表征，為人源性膠原蛋白的深入應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

梯度PCR儀 (MJMini，BIO-RAD)，電穿孔儀 (GenePulse，BIO-RAD)，150 L發(fā)酵系統(tǒng) (上海保興)，三足式離心機(jī) (遼陽(yáng)陽(yáng)光)，超濾系統(tǒng) (武漢新力協(xié)力)，中空纖維膜組件 (天津膜天膜)、蛋白純化色譜層析系統(tǒng) (Hanbon)，紫外分光光度計(jì) (752N型，上海精科)，電泳儀 (北京六一)，高效液相色譜儀 (日立)，掃描電子顯微鏡 (VEGA 3 LM (SEM)，TESCAN) 等。

1.2 材料

大腸桿菌.DH5α (天根生化)，GS115 (Invitrogen公司)，pPIC9K (Invitrogen公司，對(duì)5 709 bp處的Ⅰ位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變)，PCR MasterMix (天根生化)，DNA純化回收試劑盒 (天根生化)，質(zhì)粒小提試劑盒 (天根生化)，限制性內(nèi)切酶 (Thermo Fisher Scientific)，SolutionⅠ (TaKaRa)，CM FF (交大保賽)，C8柱，Ⅰ型膠原酶 (Gibco)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 基因工程菌的構(gòu)建

根據(jù)人Ⅰ型膠原蛋白氨基酸序列，優(yōu)選親水性的Gly-X-Y膠原肽段設(shè)計(jì)合成人源性膠原蛋白氨基酸序列，包含411個(gè)氨基酸，理論分子量約38 kDa，等電點(diǎn)為9.7，同時(shí)按照畢赤酵母密碼子偏好性設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的DNA序列(氨基酸序列及對(duì)應(yīng)核苷酸序列已提交GenBank，登錄號(hào)為MH544244，5′端添加Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)CTCGAG和KEX2酶切位點(diǎn)序列AAAAGA，3′端添加RⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)GAATTC，將設(shè)計(jì)的核苷酸序列送生工生物工程 (上海) 股份有限公司全基因合成，之后對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行Ⅰ和RⅠ雙酶切，連接至載體pPIC9K，獲得pPIC9K-COL表達(dá)載體。然后，將pPIC9K-COL電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115菌株，經(jīng)G418 (Geneticin，遺傳霉素) 及搖瓶篩選，獲得人源性膠原蛋白基因工程菌。

1.4 膠原的發(fā)酵及純化

利用150 L中試發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行人源性膠原蛋白發(fā)酵，參考Invitrogen公司“Fermentation Process Guidelines”方法，發(fā)酵參數(shù)為：pH 5.0，溫度29 ℃，溶氧控制大于30%，待發(fā)酵液濕菌重達(dá)200 g/L時(shí)進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間約為48 h，放罐，經(jīng)離心機(jī)進(jìn)行固液分離，利用0.22 μm中空纖維膜超濾，去除殘留的菌體及雜質(zhì)，然后使用截留分子量為10 kDa的中空纖維膜超濾，收集截留液，將截留液進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析 (A相：pH 6.0，10 mmol/L檸檬酸緩沖液；B相：A相+ 1 mol/L NaCl)，用5%的B相洗脫，收集洗脫液，洗脫液經(jīng)10 kDa卷式膜超濾濃縮脫鹽，冷凍干燥，即可獲得人源性膠原蛋白凍干品純品，并經(jīng)HPLC高效液相色譜分析純度及含量測(cè)定 (C8柱，A相：超純水+0.1% TFA；B相：乙腈+0.1% TFA)。

1.5 膠原的N端測(cè)序

通過(guò)島津全自動(dòng)蛋白質(zhì)多肽測(cè)序儀 (PPSQ-33A) 對(duì)人源性膠原蛋白N端序列15個(gè)氨基酸進(jìn)行分析，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成檢測(cè)。

1.6 膠原的分子量研究

對(duì)人源性膠原蛋白純化后凍干品進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (5800 MALDI-TOF/ TOF) 檢測(cè)其相對(duì)分子量，判斷重組人源性膠原蛋白的實(shí)際分子量，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司檢測(cè)。

1.7 膠原的氨基酸分析

采用的實(shí)驗(yàn)方法是使用6 mol/L鹽酸對(duì)人源性膠原蛋白樣品進(jìn)行酸水解成游離氨基酸，然后用PITC對(duì)游離氨基酸進(jìn)行衍生化處理，之后使用高效液相色譜對(duì)衍生化的氨基酸樣品進(jìn)行分析。最后使用Labsolution軟件對(duì)高效液相色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算確定樣品的氨基酸組成摩爾百分比 (由生工生物工程 (上海) 股份有限公司檢測(cè))。

1.8 膠原的膠原酶降解分析

利用1 mg/mL Ⅰ型膠原酶消化液溶解重組人源性膠原蛋白凍干品樣品，使膠原的濃度為1 mg/mL，37 ℃水浴作用4 h，同時(shí)以牛Ⅰ型膠原蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，牛血清白蛋白 (BSA) 為陰性對(duì)照，利用SDS-PAGE檢測(cè)。

1.9 膠原凍干品的掃描電鏡分析

采用掃描電子顯微鏡 (VEGA 3 LM (SEM)，TESCAN) 對(duì)重組人源性膠原蛋白凍干品進(jìn)行掃描顯像。

1.10 膠原的細(xì)胞毒性測(cè)定

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞L929 (小鼠成纖維細(xì)胞) 稀釋配成6×103/mL的單細(xì)胞懸液；取3塊96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL的細(xì)胞懸浮液，置于5% (體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h；棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL實(shí)驗(yàn)組 (100 mg/L，500 mg/L，1 000 mg/L，5 000 mg/L，10 g/L) 配制溶液，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組 (單純細(xì)胞培養(yǎng)液) 和陽(yáng)性對(duì)照組 (4% DMSO)，每組8孔；將3塊培養(yǎng)板移入37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中，分別于接種后48 h、96 h各取出1塊培養(yǎng)板，每孔再加入MTT (噻唑藍(lán)) 50 μL，繼續(xù)在37 ℃條件下培養(yǎng)2 h，吸棄原培養(yǎng)液，立即加入二甲基亞砜，每孔150 μL，室溫放置并輕輕振蕩10–15 min；選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值 ()，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率RGR (%) = (實(shí)驗(yàn)組吸收值/陰性對(duì)照組吸收值)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因工程菌的構(gòu)建

對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體pPIC9K-COL電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115，利用搖瓶發(fā)酵篩選，甲醇誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，獲得的目的蛋白條帶明確，雜蛋白較少，表達(dá)菌株可用于下一步試驗(yàn)。

圖1 人源性膠原蛋白搖瓶篩選SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

圖2 人源性膠原蛋白發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程不同誘導(dǎo)時(shí)間檢測(cè)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

2.2 膠原的發(fā)酵及純化

從甲醇誘導(dǎo)開始，每隔4 h取樣收集上清，10倍稀釋后，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2所示，甲醇誘導(dǎo)后，重組人源性膠原蛋白隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)，48 h放罐后，經(jīng)HPLC檢測(cè)，發(fā)酵上清液中重組人源性膠原蛋白的表達(dá)量最高達(dá)4.5 g/L，且在發(fā)酵過(guò)程中人源性膠原蛋白降解少，雜蛋白少，有利于后期的純化。

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)固液分離、兩步超濾粗純以及CM離子交換層析即可獲得高純度的重組人源性膠原蛋白，如圖3所示，粗純重組人源性膠原蛋白樣品上樣CM FF高流速瓊脂糖凝膠柱，穿柱為發(fā)酵色素物質(zhì)及未掛柱的雜蛋白，收集5% B相洗脫峰即為目的蛋白，30% B相洗脫的為雜質(zhì)。最后，將收集的5% B相洗脫液經(jīng)超濾脫鹽、冷凍干燥，即可獲得純品，純品經(jīng)HPLC檢測(cè)純度，結(jié)果如圖4，純度達(dá)95%以上。

圖3 人源性膠原蛋白離子交換層析過(guò)程檢測(cè)

圖4 HPLC檢測(cè)重組人源性膠原蛋白純度色譜圖

2.3 膠原的N端測(cè)序

蛋白質(zhì)的生物合成起始于N端，是否獲得與理論的N端序列，是重組蛋白的關(guān)鍵，因此，對(duì)于重組蛋白質(zhì)N端序列的分析，是鑒定重組表達(dá)蛋白的最直接的方法。人源性膠原蛋白經(jīng)N端測(cè)序分析，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)的N端序列一致，序列如下：NH2-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Pro-Gly-Asn-Pro- Gly-Lys-Pro-Gly-Ser-Pro。

2.4 膠原的分子量測(cè)定

分子質(zhì)量作為蛋白質(zhì)樣品的主要特征參數(shù)之一，是確定一種新型蛋白、進(jìn)行蛋白質(zhì)后續(xù)研究活動(dòng)的重要前提。本研究設(shè)計(jì)的重組人源性膠原蛋白理論分子量為38 kDa，但從圖1和圖2中可以看出，在SDS-PAGE結(jié)果中顯示目的蛋白處于分子量Marker的45–66.2 kDa之間，大于理論分子量因此對(duì)純化后的凍干樣品進(jìn)行MALDI-TOF/TOF分子量測(cè)定，以鑒定其實(shí)際分子量，結(jié)果顯示為38 359 Da，與理論分子量一致 (圖5)。分析電泳表觀分子量大于實(shí)際分子量，可能與膠原蛋白的Gly-X-Y氨基酸組成有關(guān)。

圖5 人源性膠原蛋白分子量測(cè)定結(jié)果

2.5 膠原的氨基酸分析

氨基酸組成分析是多肽蛋白質(zhì)化學(xué)研究中最基本的內(nèi)容之一。通過(guò)氨基酸組成分析可以初步了解多肽蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究提供科學(xué)的信息。重組人源性膠原蛋白經(jīng)氨基酸組成分析見(jiàn)表1，結(jié)果顯示實(shí)測(cè)氨基酸與理論氨基酸個(gè)數(shù)和摩爾百分比一致。

2.6 膠原的膠原酶降解分析

膠原酶具有特異性降解膠原蛋白特性，能夠特異性地識(shí)別膠原蛋白序列中Pro-X-Gly-Pro序列 (該序列高頻率出現(xiàn)在膠原中，很少發(fā)現(xiàn)于其他蛋白中) 并切割該序列中性氨基酸 (X) 和甘氨酸 (Gly) 之間的肽鍵，將膠原蛋白降解為大小不一的肽段。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)膠原酶降解兩批次生產(chǎn)的重組人源性膠原蛋白 (1213批和1214批)和牛Ⅰ型膠原，人源性膠原蛋白具有與牛Ⅰ型膠原蛋白相同的降解特性，降解后電泳圖中只能觀察到膠原酶的特征性條帶，而牛血清白蛋白 (BSA) 幾乎不能被降解，結(jié)果見(jiàn)圖6。

表1 氨基酸分析結(jié)果

2.7 膠原凍干品的掃描電鏡分析

圖7展示了兩張放大倍率分別為200、500倍的掃描電鏡譜圖，從圖中可以看出人源性膠原蛋白凍干品具有明顯的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)預(yù)示其具有應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的潛力。

2.8 膠原的細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)不同濃度重組人源性膠原蛋白促L929細(xì)胞增殖作用，陰性對(duì)照組及樣品組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，根據(jù)計(jì)算的RGR值 (表2) 及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)表評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (表3)，對(duì)樣品細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，樣品組48 h和96 h，0.1–5 g/L濃度細(xì)胞毒性反應(yīng)均為0級(jí)，而樣品組10 g/L濃度細(xì)胞毒性反應(yīng)為1級(jí)，分析原因是因?yàn)槟z原濃度達(dá)10 g/L時(shí)，樣品的滲透壓已超過(guò)細(xì)胞的正常滲透壓，從而影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

綜上所述，重組人源性膠原蛋白無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，具有良好的細(xì)胞相容性，滿足作為生物材料的要求。

圖6 人源性膠原與牛Ⅰ型膠原降解分析

圖7 人源性膠原蛋白凍干品的SEM圖

表2 48 h和96 h細(xì)胞增殖率測(cè)定

表3 細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性分級(jí)

3 討論

重組膠原蛋白作為一種優(yōu)良的生物材料，已廣泛得到應(yīng)用，如2018年張斌杰等[10]利用重組人源膠原制備的凝膠可有效促進(jìn)深Ⅱ度燒傷患者傷口愈合，有效提高愈合質(zhì)量，2017年李偉娜等[11]發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達(dá)獲得的Ⅲ型類人膠原在胃粘膜的修復(fù)具有顯著的作用；2015年Islam等[12]將重組人膠原蛋白進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，獲得重組人膠原基角膜替代物，展現(xiàn)了其優(yōu)良的生物安全性和良好的光學(xué)和力學(xué)性能，為角膜疾病患者帶來(lái)曙光。重組人源Ⅱ型膠原蛋白能刺激細(xì)胞外軟骨基質(zhì)的更新合成，被應(yīng)用于軟骨再生[13]。另外，重組膠原蛋白與其他天然生物材料、人工合成材料及納米材料聯(lián)合使用，使得復(fù)合材料既無(wú)免疫原性，同時(shí)又具備了良好的細(xì)胞相容性、一定的機(jī)械強(qiáng)度和可控的生物降解速率，以便為組織工程修復(fù)組織和器官缺損提供更為優(yōu)良的支架材料[14]。以重組膠原蛋白為原材料的Ⅱ類醫(yī)療器械目前已廣泛應(yīng)用于臨床，如山西錦波生物的醫(yī)用重組人源膠原蛋白功能敷料[15]以及西安巨子生物的類人膠原蛋白敷料[16-18]，在皮膚屏障功能損傷修復(fù)的臨床應(yīng)用中具有顯著作用。

文中采用畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)人源性膠原蛋白，獲得的膠原降解少，發(fā)酵上清液表達(dá)量高達(dá)4.5 g/L，經(jīng)過(guò)超濾粗純及陽(yáng)離子交換精純即可獲得純度大于95%的人源性膠原蛋白，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，利于人源性膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)化。同時(shí)，對(duì)于獲得的人源性膠原蛋白進(jìn)行表征，經(jīng)過(guò)氨基酸N端測(cè)序、分子量測(cè)定、氨基酸分析及膠原酶降解試驗(yàn)，確定獲得的蛋白與設(shè)計(jì)的理論人源性膠原蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)一致；并經(jīng)掃描電鏡分析及細(xì)胞毒性試驗(yàn)，確定人源性膠原蛋白凍干品具有多孔纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及優(yōu)良的細(xì)胞相容性，預(yù)示其具備作為生物醫(yī)學(xué)材料的潛質(zhì)，為人源性膠原蛋白在敷料、組織工程、美容等方向的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Preparation and characterization of recombinant human-source collagen

Zengmiao Hou, Xiaoying Li, Min Li, Jinfang Yang, Xiaolin Yang, and Jinli Zhao

Shaanxi HuiKang Bio-Tech Co Ltd., Xi’an 710054, Shaanxi, China

This study aimed to obtain a recombinant human-source collagen for industrialization. First, based on the Gly-X-Y sequence of human type I collagen, we optimized the hydrophilic Gly-X-Y collagen peptide, designed the human collagen amino acid sequence and the corresponding nucleotide sequence. Next, the expression vector pPIC9K-COL was constructed via endonuclease digestion technology. We obtained an engineering strain of human-source collagen by electrotransforming, and then it was fermented, purified and identified. As a result, the expression level reached 4.5 g/L and the purity was over 95%. After amino acid N-terminal sequencing, molecular weight analysis, amino acid analysis and collagenase degradation test, we confirmed that the obtained collagen was consistent with designed primary structure of human-source collagen. After freeze-drying, we analyzed the collagen by scanning electron microscope and cell cytotoxicity, confirming that the collagen has porous fiber reticular structure and superior cytocompatibility. This indicates that human-source collagen has potential to be applied as biomedical material. In conclusion, we successfully obtained the expected human-source collagen and laid a foundation to its further application.

collagen, human-source,, biomaterial

June 29, 2018;

September 12, 2018

Yanta District Science and Technology Enterprise Small Giant Growing Plan (No. XJR1504).

Jinli Zhao. Tel/Fax: +86-29-83395165; E-mail: zhjl999@163.com

西安市雁塔區(qū)科技企業(yè)小巨人計(jì)劃(No. XJR1504) 資助。

2018-10-18

10.13345/j.cjb.180266

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181015.1457.004.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)