鼠李糖乳桿菌在防御鼠傷寒沙門菌感染中的保護作用

邵麗娜，馮博，廖野，段冰潔，楊文濤，王春鳳，胡靜濤

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一類無芽孢的、革蘭氏陽性細菌，作為FAO和WHO定義的益生菌重要代表成員，在動物體內(nèi)發(fā)揮著益生功能。一方面，乳酸菌本身能在腸道內(nèi)定植、維護腸道菌群平衡，通過產(chǎn)生有機酸、細菌素等抗菌物質(zhì)抑制腸道內(nèi)有害菌的生長[1]；另一方面，乳酸菌在腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要作用，因其特有的定植位置和益生功能與腸道黏膜底層細胞關(guān)系密切、參與免疫細胞的調(diào)節(jié)和活化。因此，乳酸菌常應用于預防和治療腸道病原菌感染引起的炎癥和腹瀉[2-3]。由于乳酸菌成員眾多、菌株作用復雜多樣，因此在影響機體免疫調(diào)節(jié)效應方面具有很強的菌株依賴性。部分菌株在宿主病理條件下(如壞死性小腸結(jié)直腸炎和過敏性機體)發(fā)揮抑制炎癥效應；而某些菌株在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，其能通過促進TNF-α、IL-12和IL-8等細胞因子從而促進炎癥發(fā)生。這些有免疫調(diào)節(jié)活性的菌株在活菌或滅活的情況下，均得到了相似的結(jié)果[4]。盡管如此，已知免疫活性較好的菌株仍然有限，本實驗以在抑制慢性腸炎等方面具有潛在效應的LGG作為模式菌株[5]，深入研究LGG參與機體的免疫調(diào)節(jié)作用，以開發(fā)更多益生菌株的潛在作用。

鼠傷寒沙門菌為革蘭氏陰性菌，通過食入被污染的水造成人和動物胃腸道系統(tǒng)疾病[6]。該病原能夠耐受胃腸道的酸性環(huán)境，進入小腸后，侵入腸道粘液層，入侵的細菌可被消化酶、分泌型IgA、抗菌肽以及其它固有免疫防御分子所清除。作為一種腸道模式病原菌，能在腸道中大量繁殖破壞腸黏膜上皮細胞屏障及菌群的平衡從而引發(fā)腸道類疾病。此外，它還能夠通過巨噬細胞攝取從而破壞細胞緊密連接，進而轉(zhuǎn)移到黏膜下層，造成動物腸道疾病。這種逃逸免疫系統(tǒng)是沙門菌存活的重要機制[7]。而LGG在建立黏膜屏障，提高免疫機能和活化抗原遞呈細胞如巨噬細胞(Macrophage，Mφ)等方面具有突出優(yōu)勢[8]。本實驗通過構(gòu)建鼠傷寒沙門菌的腸炎模型，以評價LGG對該模型的防御保護作用，為LGG在預防和治療腸道病原菌感染方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及菌株

1.1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠，購買于長春億斯試驗動物技術(shù)有限公司，均飼養(yǎng)在恒溫(21～22 ℃)房間。

1.1.2 實驗菌株 鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG, LGG)ATCC53103由吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心實驗室保存,鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium，Sty)SL1344由河南科技大學程相朝教授惠贈并于吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 硫酸鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；瓊脂粉、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、蘇木精-伊紅染色(北京化學制劑公司)；4%多聚甲醛(solarbio)； PBS緩沖劑(HyClone)； mouse NO Elisa試劑盒、IL-10 Elisa試劑盒、IL-12 Elisa試劑盒(上海朗頓)。高溫烘箱DHG-9240A (上海一恒公司)；低溫超速離心機3V3O(德國SIGMA公司)；電子分析天平ME204(島津國際貿(mào)易(上海)有限公司)；培養(yǎng)箱LRH-250F(上海一恒公司)；漩渦振蕩器MX-S(大龍興創(chuàng)公司)；全波長酶標儀Multiskan Go(Thermo Fisher Scientific)。

1.3 鼠傷寒沙門菌感染腸炎模型的建立及分組

1.3.1 腸炎模型建立 6～8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠口服硫酸鏈霉素20 mg/100μL，提供飲水和飲食。鏈霉素處理24 h后，給小鼠口服5×107CFU/100μL的鼠傷寒沙門菌[9]。感染后48 h無菌收取腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟進行器官指數(shù)和沙門菌荷菌數(shù)檢測，H&E染色檢測腸道的病理變化，ELISA檢測腸道細胞因子分泌水平等。

1.3.2 實驗分組 將小鼠隨機分為4組，每組5只。第1組為生理鹽水對照組(命名為Saline)：每天灌胃100 μL生理鹽水，連續(xù)灌胃9 d。第2組為鼠李糖乳桿菌對照組(命名為LGG)：在造模前提前7 d灌胃5×108CFU/100μL鼠李糖乳桿菌，此后灌胃等量生理鹽水直到第9天；第3組為沙門菌感染模型組(命名為Sty)：在造模前提前7 d灌胃100 μL生理鹽水；第4組為鼠李糖乳桿菌干預組(命名為LGG+Sty)：造模前提前7 d灌胃5×108CFU/100μL鼠李糖乳桿菌，Sty組和LGG+Sty組第8天開始按照1.3.1方法感染鼠傷寒沙門菌，實驗重復3次，實驗過程中無小鼠死亡。

1.4 腸道病理分析 無菌PBS沖洗盲腸、結(jié)直腸內(nèi)容物，截取1 cm腸段固定于4%多聚甲醛中，石蠟切片及蘇木精-伊紅染色：梯度脫水-透明-浸蠟-包埋-切片-烤片-脫蠟-水化-蘇木精染核-1%鹽酸分化-0.5%氨水反藍-伊紅染色-梯度脫水-透明-封片。具體參考Myunghoo Kim[10]的步驟,并對病理損傷進行分析。

1.5 器官指數(shù)分析 取小鼠脾臟、肝臟、盲腸、結(jié)直腸樣品進行稱重，按照器官重量/尸重，計算器官指數(shù)，進行統(tǒng)計。

1.6 器官中沙門菌荷菌數(shù)的檢測 無菌取脾臟、肝臟，稱重后將樣品用預冷PBS進行研磨并稀釋。取100 μL稀釋好的樣品涂布在濃度為20 mg/mL硫酸鏈霉素的LB瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察菌落狀態(tài)并計數(shù)。

1.7 細胞因子檢測 PBS沖洗取盲腸內(nèi)容物并置于研缽中液氮研磨，4 ℃ 3500 r/min離心20 min，取上清用于檢測組織中分泌的細胞因子水平，檢測方法按照eBioscience ELISA試劑盒說明書方法操作，并在酶標儀450nm處讀取吸光值。

1.8 體重及存活率檢測 采取1.3.1和1.3.2方法進行模型建立及分組，監(jiān)測小鼠體重并觀察小鼠一般狀態(tài)及記錄死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 LGG對沙門菌引起腸道損傷的緩解作用 病理檢測結(jié)果如圖1顯示，LGG和Saline組結(jié)直腸和盲腸腺體完整，無出血點；Sty組腸道的大部分腺體被破壞，腸黏膜脫落，有大量的炎性細胞浸潤以及出血點；而LGG+Sty組腺體結(jié)構(gòu)較完整，有少量炎性細胞浸潤和出血點。結(jié)果表明LGG可以有效緩解鼠傷寒沙門菌造成的腸道病理損傷。

圖1 結(jié)直腸和盲腸的病理變化Fig 1 Colon and cecum pathology change

2.2 LGG能改善沙門菌引起小鼠的器官損傷 檢測脾臟器官指數(shù)如圖2a、2b所示，Sty組脾臟眼觀明顯比Saline組腫大且器官指數(shù)顯著增加(P<0.01)，而LGG+Sty組脾臟腫大有所緩解，并且器官指數(shù)較Sty組明顯下降(P<0.05)。盲腸器官指數(shù)如圖2c所示，Sty組盲腸內(nèi)容物減少且重量減輕。 Sty與LGG+Sty組比較差異顯著(P<0.05)，LGG和LGG+Sty組盲腸器官指數(shù)較Sty組有所改善。結(jié)果表明LGG能緩解沙門菌引起小鼠的器官損傷。

a：脾臟眼觀病理變化程度；b：脾臟的器官指數(shù);c：盲腸的器官指數(shù)a: Degree of pathological changes in the spleen eye; b: Organ index of the spleen; c: Organ index of the cecum圖2 脾臟及盲腸的器官指數(shù)Fig 2 Organ index of the cecum and spleen

2.3 LGG對沙門菌侵襲器官組織的影響 對小鼠盲腸、脾臟、肝臟以及腸系膜淋巴結(jié)的沙門菌荷菌數(shù)檢測，結(jié)果如圖3所示。Saline和LGG組器官中并未檢測到沙門菌，而LGG+Sty比Sty組脾臟和肝臟的荷菌數(shù)顯著減少(P<0.001)，腸系膜淋巴結(jié)的荷菌數(shù)顯著減少(P<0.01)，說明LGG能有效抑制沙門菌侵襲其他器官組織。

圖3 沙門菌在體內(nèi)器官定植分布數(shù)量檢測Fig 3 Detection of S.typhimurium loads in tissue

2.4 LGG對細胞因子分泌水平的影響 如圖4a、4b所示LGG+Sty組一氧化氮(NO)和白細胞介素-12(IL-12)分泌水平顯著降低 (P<0.001)。而如圖4c所示白細胞介素-10(IL-10)分泌顯著增加(P<0.05)。初步表明LGG可能通過調(diào)節(jié)Th2型細胞因子的分泌，維持腸道免疫平衡，緩解腸道炎癥反應。

2.5 LGG對小鼠體重及死亡情況的影響 小鼠體重監(jiān)測結(jié)果如圖5a所示，Saline和LGG組小鼠體重緩慢上升，LGG+Sty比與Sty組體重丟失有所緩解。小鼠存活率監(jiān)測如圖5b可見Saline和LGG組無小鼠死亡。Sty組在第11天全部死亡，而LGG+Sty與Sty組相比死亡率有所降低。結(jié)果表明，LGG對感染鼠傷寒沙門菌的小鼠體重丟失有一定的改善，并且能緩解沙門菌引起的小鼠死亡。

a:促進炎性細胞因子IL-12分泌水平； b:炎性介質(zhì)細胞因子NO分泌水平；c：抑制炎性細胞因子IL-10分泌水平a: Promote inflammatory cytokine IL-12 secretion level; b: Inflammatory mediator cytokine NO secretion level;c: Inhibit inflammatory cytokine IL-10 secretion level圖4 盲腸組織細胞因子檢測Fig 4 Cecal tissue cytokine detection

a：小鼠的體重情況監(jiān)測；b：小鼠的死亡情況監(jiān)測a: Detection of body weight in mice; b: Detection of death in mice圖5 小鼠體重變化及存活率的監(jiān)測Fig 5 Detection of body weight change and survival rate in mice

3 討論與結(jié)論

鼠傷寒沙門菌是一種胞內(nèi)寄生的腸道病原菌，能引起人和動物腸道疾病。近年來，濫用抗生素增強了細菌的耐藥性，破壞了微生態(tài)環(huán)境。為尋找抗生素的替代物，益生菌以能在腸道定植的優(yōu)勢逐漸成為研究熱點。本實驗評估了LGG在鼠傷寒沙門菌誘導腸炎模型中的作用，發(fā)現(xiàn)LGG+Sty組能改善腸道組織的病理損傷，減少鼠傷寒沙門菌侵襲器官組織的能力，改善小鼠的體重及死亡率，說明LGG能緩解鼠傷寒沙門菌引起的腸道炎癥，這與Jian Ji等[12]的研究一致。這一過程可能與LGG參與激活機體的免疫防御功能、緩解機體的炎癥反應有關(guān)。本實驗也發(fā)現(xiàn)LGG能調(diào)節(jié)腸道Th1和Th2細胞因子的分泌水平，減少NO和IL-12分泌以及增強IL-10分泌，這與Trine Eker Christoffersen等[13]的研究一致，表明乳酸菌在調(diào)節(jié)和維持腸道免疫平衡方面具有重要作用[14]。這些研究為LGG在緩解鼠傷寒沙門菌誘導腸炎的機制研究奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌對機體的免疫調(diào)節(jié)機制十分復雜，免疫細胞(如Mφ)在免疫調(diào)節(jié)的過程中也扮演著重要角色。LGG與Mφ共作用，使Mφ產(chǎn)生NO、IL-12和IL-10等細胞因子，調(diào)節(jié)Mφ的免疫功能及吞噬能力，參與模式識別受體(PRRs)包括ToLL樣受體(TLRs)、Notch、核因子κB(NF-κB)信號通路等，這些通路之間的相互作用調(diào)節(jié)Mφ的免疫功能，降低機體的炎癥反應。因此我們有必要對LGG緩解鼠傷寒沙門菌誘導的腸炎作用機制進一步探索，從而為炎癥疾病提供新的治療方向。