兔病毒性出血癥滅活疫苗效力檢驗替代方法研究

高金源，劉丹，陳建，秦義嫻，郎洪武

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

兔病毒性出血癥(Rabbit Haemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種家兔高發(fā)病率、高死亡率的傳染性疫病，臨床多表現(xiàn)為發(fā)熱、精神不振、突然死亡，疫苗接種仍是預防RHD的最有效方法[1-2]。

在《中國獸藥典》2015年版三部中[3]，RHD滅活疫苗效力檢驗采用經(jīng)典的家兔免疫攻毒方法來評價家兔攻毒后的保護效果。由于該方法需要配備負壓動物舍，攻毒后也需要較長觀察時間,存在試驗成本高、周期較長、操作繁瑣等缺點。本試驗在制備了HI試驗用RHDV 血凝(HA)抗原、陽性血清、陰性血清的基礎上，確認了免疫攻毒保護與免疫血清HI抗體效價之間的平行關系，并采用免疫血清HI效價測定方法進行了RHD滅活疫苗的效力檢驗應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 家兔 RHD血清抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上健康新西蘭兔，由濟源市陽光兔業(yè)科技有限公司、濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心、四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場購入。

1.1.2 RHDV AV34株肝臟組織毒，由齊魯動物保健品有限公司(毒價為105.0LD50/mL)、華派生物工程集團有限公司(毒價為105.1LD50/mL)、山東綠都生物科技有限公司(毒價為106.1LD50/mL)及中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室(毒價為105.5LD50/mL)提供。

1.1.3 1%新鮮人“O”型紅細胞 由齊魯動物保健品有限公司、華派生物工程集團有限公司提供。

1.1.4 RHD滅活疫苗 規(guī)格為20 mL(頭份)/瓶，由齊魯動物保健品有限公司(9批，批號分別為1702007、1702008、1704019、1704020、1706023、1706024、1707029、1708037、1708038)、華派生物工程集團有限公司(8批，批號分別為2017001～2017008)、山東綠都生物科技有限公司(2批，批號分別為1803003、1804004)提供。

1.1.5 RHDV HA抗原 (HA價為1∶128)、RHD陽性血清(HI價為1∶128)、RHD陰性血清(HI價<1∶8)、PBS(0.01 mol/L，pH7.2)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室提供。

1.2 方法

1.2.1 RHDV HA抗原制備 用RHDV南京株接種3月齡以上的健康易感家兔，無菌采集接種后24～96 h瀕死或剛死兔的有典型病理變化的肝臟；將肝臟組織用適量的PBS進行搗碎，6000 g離心15 min，取上清液，制備成8倍稀釋的病毒懸液；加入β-丙內(nèi)酯溶液，使其含量為1/4000，混合均勻，放入4 ℃冰箱作用24 h，再放入37 ℃水浴水解2 h，放入4 ℃冰箱保存。同時進行無菌檢驗[2]和HA效價測定[1]。無菌檢驗結(jié)果應無菌生長，滅活病毒HA價應不低于1∶64。

1.2.2 RHD陽性血清制備 采用常規(guī)微量HI試驗法[1]，選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔，先用商品化的RHD滅活疫苗進行基礎免疫，再用RHDV強毒加強免疫2次，中間間隔14 d，最后一次免疫后21 d，無菌采集血液，提取血清，混合后進行無菌檢驗和HI效價測定。無菌檢驗結(jié)果應無菌生長，HI價應不低于1∶128。

1.2.3 RHD陰性血清制備 采用常規(guī)微量HI試驗法，選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔，無菌采集血液，提取血清，混合后進行無菌檢驗和HI效價測定。無菌檢驗結(jié)果應無菌生長，HI價應小于1∶8。

1.2.4 疫苗免疫攻毒與血清HI效價的平行關系 采用常規(guī)微量HI試驗法，選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔35只。將RHD滅活疫苗搖勻后進行家兔免疫，取1/2 頭份、1/4頭份、1/8頭份疫苗各皮下注射家兔10只，飼養(yǎng)觀察14 d。同時設立非免疫攻毒對照家兔5只。家兔免疫14 d后，對所有試驗家兔進行采血，每只家兔采血4.0 mL，提取血清，56 ℃滅活30 min，用于血清HI價測定。家兔采血后，對所有家兔進行攻毒，每只家兔皮下注射RHDV 1 mL(含1000 LD50/mL)。每日觀察家兔健康情況，飼養(yǎng)觀察7 d，記錄家兔發(fā)病死亡情況；同時，無菌采集免疫攻毒家兔肝臟組織，研磨并稀釋4倍后，3000 g離心15 min后，取上清液測定血凝情況，以監(jiān)測RHDV兔體內(nèi)復制增殖情況。攻毒對照家兔應至少死亡4只，試驗成立。統(tǒng)計不同HI效價的攻毒保護情況，當免疫攻毒保護家兔4倍肝臟組織液無血凝性時，以免疫攻毒100%保護家兔的血清最低HI效價作為免疫攻毒保護判定的最低標準。

1.2.5 疫苗效力檢驗替代方法的應用 與3家企業(yè)19批RHD滅活疫苗現(xiàn)行免疫攻毒法同步進行，攻毒前無菌采集免疫家兔血液，提取血清，進行HI效價測定，根據(jù)1.2.4中確定的免疫攻毒保護判定標準，比較兩種方法的效力檢驗結(jié)果，評價HI效價測定方法替代現(xiàn)行免疫攻毒法的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHDV HA抗原、陽性血清、陰性血清鑒定 結(jié)果見表1。HI法的各組分鑒定結(jié)果均符合其質(zhì)量標準要求，可以滿足HI效價測定的需要。

2.2 疫苗免疫血清不同HI效價水平的免疫攻毒保護情況統(tǒng)計結(jié)果 見表2。

表1 HI法組分鑒定結(jié)果Tab 1 Identification results of HI component

“-”：檢測結(jié)果為陰性； “/”：不涉及

“-”： negative； “/”：unconcerned

表2 不同HI效價水平的攻毒保護結(jié)果Tab 2 Protection rate of rabbits with different HI titre levels

“-”代表保護；“HA-”代表無血凝

“-”protection; “HA-”no hemagglutination

攻毒對照家兔均發(fā)病死亡；免疫攻毒獲得保護家兔的4倍肝臟組織液均無血凝性，顯示無明顯病毒增殖情況；RHD滅活疫苗免疫家兔血清HI效價低于1∶16時(6份)，對應的攻毒家兔均發(fā)病死亡；免疫家兔血清HI效價為1∶16時(8份)，對應攻毒家兔5只獲得保護，而另3只均發(fā)病死亡；免疫家兔血清HI效價不低于1∶32時(21份)，對應的攻毒家兔均獲得保護。

2.3 疫苗效力檢驗替代方法的應用 疫苗效力檢驗現(xiàn)行方法(免疫攻毒法)與替代方法(HI效價測定方法)的應用結(jié)果比較見表3。

表3 2種效力檢驗方法應用結(jié)果比較Tab 3 Comparison of the two methods applicated in potency test

所有對照組家兔血清HI效價不高于1∶8，且在攻毒后均死亡；在19批RHD滅活疫苗效力檢驗的免疫攻毒方法與血清HI效價測定方法的比較應用試驗中，替代方法(HI效價測定方法)與現(xiàn)行方法(免疫攻毒法)檢驗結(jié)果符合率為100%。

3 結(jié) 論

RHD于1984年由我國首次報道[4]，隨后確認該疫病由杯狀病毒科杯狀病毒屬的RHDV引起。由于RHDV只能在兔體內(nèi)增殖，不能在任何組織細胞上有效增殖[4]，因此，尚未建立在細胞上進行抗體定量檢測方法。雖然發(fā)現(xiàn)存在無血凝性的毒株[5]，但可以利用具有血凝性的RHDV毒株，通過血清HI效價的測定對家兔血清抗體進行定量[1,6-7]。同時，RHD滅活疫苗免疫血清HI效價與RHDV的攻毒保護密切相關，但免疫攻毒臨床保護的HI效價臨界值缺少明確一致的數(shù)據(jù)[8-10]。目前，RHD滅活疫苗效力檢驗的國內(nèi)外標準方法均為免疫攻毒法[3,11]，雖然攻毒劑量要求不同，但均是通過觀察免疫家兔攻毒后是否獲得臨床保護來判定免疫效果。為了采用免疫血清HI效價測定方法替代現(xiàn)有的標準方法，按照《中國獸藥典》2015年版三部的攻毒劑量標準，明確了攻毒臨床保護的免疫血清HI效價標準應不低于1∶32。同時，與19批RHD滅活疫苗效力檢驗免疫攻毒的標準方法進行比對的應用表明，標準方法中免疫攻毒臨床保護的家兔，其免疫血清HI效價均未低于1∶32?？梢?，只要免疫血清HI效價不低于1∶32，就能夠確保免疫家兔攻毒后可獲得臨床保護，用免疫兔血清HI效價均不低于1∶32作為RHD滅活疫苗效力檢驗中判定攻毒臨床保護的標準確實可行。

在《中國獸藥典》2015年版三部中，RHD滅活疫苗的安全檢驗和效力檢驗均采用HI效價測定方法篩選檢驗用敏感家兔，生產(chǎn)企業(yè)熟悉該檢測方法。同時，通過免疫家兔血清HI效價來評價疫苗免疫效果，疫苗生產(chǎn)企業(yè)可以避免使用負壓動物舍，縮短檢驗時間，也可節(jié)約檢驗成本。該研究也可為下一版《中國獸藥典》的修訂提供數(shù)據(jù)。