土壤中的土霉素對蔗糖酶活性的影響

權(quán) 剛

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 咸陽 721000)

在土壤中，有一類活性物質(zhì)，被稱為土壤酶，它是由部分微生物及動植物的活體分泌物、殘體分解物、遺骸分解物等組成的，具有一定催化能力的活性物質(zhì)。它對促成土壤的發(fā)育熟化程度，提升土壤的肥力水平等方面都有重要的作用。土壤酶的種類繁多，根據(jù)其在土壤中的功能主要分為水解酶類、裂合酶類、氧化還原酶類和轉(zhuǎn)移酶類等四大類，它們各自在土壤發(fā)育過程中都有不同的作用。在水解酶類中，有一種能夠促進土壤中的蔗糖通過水解作用形成葡萄糖和果糖的重要活性物質(zhì)，稱為蔗糖酶(亦稱轉(zhuǎn)化酶)。當(dāng)土壤中的有機質(zhì)、N、P等元素，和微生物數(shù)量增多時，土壤的呼吸強度亦隨之增強，同時，蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)化率也越高，蔗糖酶的活性也就越高。它的存在，主要是通過酶促轉(zhuǎn)化作用，將植物、微生物等體內(nèi)的蔗糖，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，供其使用促進自身生長。因此，土壤中蔗糖酶的含量及其活性，影響著土壤的熟化程度和肥力狀況，也是土壤狀況評價的重要因子。

抗生素的種類繁多，有一種四環(huán)素類抗生素，在我國畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用，主要用作飼料添加劑的抗菌藥物土霉素。動物在生長過程中，攝入體內(nèi)的土霉素有20%會被身體吸收，剩余部分則通過糞尿等方式，被排出體外，而這些糞尿又通過腐殖質(zhì)肥料、漚肥等方式，作為肥料進入農(nóng)田土壤，污染土壤生態(tài)環(huán)境。土霉素殘留在土壤中，并不能及時降解，會隨著時間的推移不斷累積，而種植在土壤上的各類農(nóng)作物及各類植物又會吸收一部分，最終由人類食用而進入體內(nèi)，如果長期食用此類食物，會導(dǎo)致身體抗藥性增加，關(guān)鍵時刻藥物無法發(fā)揮效用。

目前國內(nèi)探索影響土壤環(huán)境生態(tài)的因素,更多關(guān)注的是重金屬、有機物、農(nóng)藥等，同時，還將它們作為生態(tài)毒理指標之一，研究這些物質(zhì)在土壤中的殘留累積、污染情況，以及土壤生態(tài)環(huán)境的影響情況等內(nèi)容。而對于抗生素類藥物對土壤的污染，以及用土壤酶活性來評價土壤生態(tài)環(huán)境卻少有研究。

鑒于以上情況，試驗設(shè)計在采樣土壤中，混入濃度遞增的的土霉素溶液，模擬土壤生長環(huán)境，進行暗箱培養(yǎng)，并時定量補充土樣水分，通過提取、測定不同時期的土樣，并用葡萄糖含量來表示蔗糖酶的活性，對照空白分析對土壤蔗糖酶活性的影響，并以此為研究土壤生態(tài)環(huán)境污染提供參考。

1 試驗材料與試驗方法

1.1 試驗材料材料

儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱、搖床振蕩器、離心機、電熱恒溫水浴鍋、756型紫外可見分光光度計等。供試材料：土霉素(Oxytetracycline Hydrochloride, OTC)，分子式：C22H24N2O9.HCl。分子量：496.90，純度98.9%。

試驗用土采自咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院周邊村鎮(zhèn)(南北季村)，采用棋盤法取0～20 cm的耕層土壤。土壤采回后，將大塊壓碎，再過2 mm篩，篩后土樣室內(nèi)風(fēng)干后分裝編號。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 風(fēng)干土樣在試驗之前，用蒸餾水調(diào)節(jié)土樣含水量，調(diào)至最大田間持水量的40%左右即可，裝入密封袋內(nèi)，模擬土壤生長環(huán)境，將土樣置于25℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，暗箱培養(yǎng)一周，作為新鮮土樣備測。在供試新鮮土樣中加入濃度遞增的土霉素溶液，配制成含量為0、10 mg·kg-1、17.8 mg·kg-1、32.6 mg·kg-1、56.2 mg·kg-1、100 mg·kg-1(0、0.02、0.035、0.065、0.113、0.201 mol OTC·L-1)的試驗用土。將各梯度濃度的試驗用土稱取250 g，放置于500 mL的燒杯中，并在土壤樣品中滴入蒸餾水，調(diào)節(jié)土壤水分的含量，保持在最大持水量的50%，之后，將調(diào)節(jié)好的土壤樣品，放置于25℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中進行暗箱培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每周用重量差減法計算損失的水分，用蒸餾水補充土樣水分，并適當(dāng)通氣，保持土壤活性。測定時，分別取第3、7、14、21、28、56和112 d的土樣進行測定，測定葡萄糖的含量。

1.2.2 測定方法 土樣處理：取出土樣充分混合后，采用四分法縮減，干燥、過篩進行測定。

測定方法：采用水楊酸比色法。稱取5 g土樣，加入三角瓶中(容量50 mL)，向其中加入濃度為8%的蔗糖溶液15 mL，再滴入磷酸緩沖液5mL(pH5.5)和甲苯5滴，混合后置于搖床，充分搖勻后，于恒溫箱中在37℃下，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，將土樣用離心進行過濾，取上層濾液1mL置于容量瓶中(容量50 mL)，然后，向濾液中滴入還原劑3，5-二硝基水楊酸3 mL，置于恒溫水浴鍋中，100℃的恒溫加熱5 min，取出后用流動的自來水將容量瓶冷卻3 min，用蒸餾水定容至50 mL，將比色皿在756型紫外可見分光光度計上于508 nm比色測定。

表示方法：蔗糖酶活性用24 h后土樣中葡萄糖的含量mg·g-1來表示。

1.2.3 抑制率的計算 抑制率即影響作用，表示土霉素對土壤蔗糖酶的影響。

抑制率大于零，表明土霉素的存在對土壤中蔗糖酶的活性具有促進作用；抑制率小于零，則表明土霉素的存在對土壤對蔗糖酶的活性具有抑制作用。負號僅代表抑制，數(shù)值大小表明抑制的程度。

抑制率=(A-B)/A×l00%

式中：A—空白對照的土壤蔗糖酶活性

B—加入土霉素后的土壤蔗糖酶活性

2 試驗結(jié)果與分析

按照上述測定方法，分別測定了第3、7、14、21、28、56、112天的土樣中葡萄糖含量，參照空白試驗，結(jié)果表明：土樣中的土霉素濃度不同，測定出的葡萄糖含量也不同，表征的蔗糖酶的活性也不同。如圖1所示，在第3天時，處理過的土樣，其蔗糖酶活性與對照水平相同；在第7天到第56天中，蔗糖酶的活性均低于對照水平；直到第112天時，蔗糖酶的活性又回到對照土樣的水平。

圖1 蔗糖酶活性換算結(jié)果

按照抑制率的計算方法，分別計算了第3、7、14、21、28、56、112天的處理土樣對蔗糖酶的抑制率，如圖2所示。從圖2得出，在對土樣處理后，土霉素的濃度不同，培養(yǎng)時間不同，其抑制情況也不同。第3天的土樣測定結(jié)果顯示，蔗糖酶活性幾乎沒有受到影響；第7天的土樣測定結(jié)果顯示，蔗糖酶的活性受到了強烈的影響，表現(xiàn)為抑制，其濃度最小的土樣抑制率為33%，濃度最大的土樣抑制率為37%；在培養(yǎng)的第14天，抑制作用稍有下降，但隨著土霉素濃度增高，它對蔗糖酶活性抑制作用也越大，土霉素的濃度在56.2 mg·kg-1和100 mg·kg-1時，對蔗糖酶的活性影響較為強烈，表現(xiàn)為抑制作用，抑制率均為：20%；從第21天、第28天、第56天的測定結(jié)果可以看出，蔗糖酶的活性仍然受到了強烈的影響，表現(xiàn)為抑制作用；通過測定第112天的土樣，土霉素對蔗糖酶的活性影響較小，沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，蔗糖酶的活性與第3天的水平相當(dāng)。甚至在低濃度的土樣中，土霉素對蔗糖酶的活性反而產(chǎn)生了促進作用，蔗糖酶活性為3%；但高濃度的土樣中，土霉素對蔗糖酶的活性還是表現(xiàn)為較小的抑制作用。整體上看來，在對土樣暗箱培養(yǎng)7 d后，土霉素對蔗糖酶活性的影響，均表現(xiàn)為抑制作用，而且隨著時間增長，抑制作用一直存在，直到第112天時，土樣中的蔗糖酶活性才回到了初始對照水平。

圖2 蔗糖酶活性抑制率換算結(jié)果

試驗表明，在培養(yǎng)的第7～56 d里，所有土樣中，不同濃度的土霉素都對土壤蔗糖酶的活性產(chǎn)生了影響，表現(xiàn)出明顯的抑制作用；直到第112天時，土樣中的蔗糖酶活性回到初始水平。由此可見土霉素對土壤中蔗糖酶的活性具有較大影響，這種影響與土霉素在土壤中殘留時間有關(guān)，而且作用時間是比較長的。

3 討論

通過對土壤進行加工處理，添加不同濃度的土霉素，進行暗箱培養(yǎng)，在不同的時間點測定土壤中蔗糖酶的活性。從試驗數(shù)據(jù)以及對比空白分析，土霉素的存在確實對土壤蔗糖酶的活性有影響，在初期表現(xiàn)不明顯，從第7天開始，表現(xiàn)出較強的抑制作用，而且作用時間較長，直到第112天的時候，蔗糖酶的活性又回到了初始水平。

綜上所述，土壤中的土霉素確實對蔗糖酶的活性有影響，更多的為抑制作用。此外，土霉素的降解時間較長，很容易在土壤中累積，呼吁大家應(yīng)盡量減少抗生素類藥物的使用，改善土壤的生態(tài)環(huán)境。