陜西關中地區(qū)豬大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測

魏 恒，王韋華，李娟娟，趙 毅

(1.渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714026；2.陜西省動物疫病預防控制中心，陜西 西安 710016)

豬大腸桿菌病是由病原性大腸桿菌的某些血清型引起的，以初生至斷奶階段仔豬為主的腸道感染性傳染病。根據(jù)仔豬臨診特征可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，其中仔豬黃痢常發(fā)生于生后7日齡以內(nèi)的仔豬，以生后1～3日齡最為多見；仔豬白痢主要見于生后10～30 d的仔豬，以10～20日齡居多；仔豬水腫病主要見于斷奶仔豬，尤以生長快、體況健壯，體重在10～40 kg 的仔豬最為多見。目前，該病廣泛存在于世界各地，其中仔豬黃痢和仔豬白痢在臨床上最常發(fā)生，其發(fā)病率和死亡率在仔豬疾病之中占據(jù)首位[1～2]。由于病原性大腸桿菌血清型多、且抗原多樣，仔豬發(fā)病時還常易與其他細菌和病毒混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴重影響[3]。近年來，在畜牧養(yǎng)殖過程中由于濫用和不合理應用抗菌藥物，致使大腸桿菌的耐藥性和多重耐藥現(xiàn)象時常發(fā)生，耐藥率也呈上升趨勢。目前，獸醫(yī)臨床上抗生素的療效不明顯，各養(yǎng)殖場的仔豬經(jīng)常反復發(fā)病，給豬大腸桿菌病的防控造成了很大困難。研究主要是從陜西關中地區(qū)養(yǎng)殖場采集疑似豬大腸桿菌病病料樣品178份，對采集樣品進行大腸桿菌的分離培養(yǎng)、生化試驗、致病性試驗和耐藥性檢測，為陜西關中地區(qū)豬大腸桿菌病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)病料來源從陜西關中地區(qū)養(yǎng)豬場疑似病豬或病死仔豬中，無菌采集直腸內(nèi)糞便、腸內(nèi)容物或腸系膜淋巴結，共采集病料178份。

(2)試劑麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。細菌微量生化反應管和細菌藥敏紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司。大腸桿菌質控菌株ATCC25922，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

(3)實驗動物試驗用小白鼠18～22 g，購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1.2 方法

(1)細菌分離及純化將采集的病料樣品接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h后，將紅色疑似菌落在伊紅美藍培養(yǎng)基上于37℃再培養(yǎng)18～24 h，然后選取紫黑色帶金屬光澤的疑似大腸桿菌菌落用革蘭氏染色法進行染色和鏡檢。根據(jù)觀察結果，將疑似大腸桿菌進行純化培養(yǎng)，4℃冷藏備用。

(2)生化試驗用接種針將純化培養(yǎng)的疑似大腸桿菌菌株分別接種于微量生化反應管中，37℃培養(yǎng)18～24 h觀察并記錄結果。

(3)致病性試驗將生化試驗鑒定后的大腸桿菌菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h，取0.2 mL純培養(yǎng)后的營養(yǎng)肉湯采用腹腔注射方法接種小白鼠，試驗組每個菌株培養(yǎng)物分別接種3只小白鼠，用無菌營養(yǎng)肉湯作為對照組。接種后觀察試驗組小白鼠的發(fā)病和死亡情況，并將死亡的小白鼠進行剖檢，采集臟器，進行細菌的分離純化和生化試驗，鑒定結果與大腸桿菌特征一致的菌株即為致病性大腸桿菌。

(4)藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)對分離菌株進行16種常用抗菌藥物的耐藥性進行檢測，用大腸桿菌標準菌株ATCC25922進行質控。將分離菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h，用生理鹽水調節(jié)菌液濃度至0.5麥氏濁度(含菌量約1×108cfu·mL-1)，然后用無菌棉簽蘸取菌液適量，在MH瓊脂培養(yǎng)基均勻涂抹，待干后，在培養(yǎng)基上分別將藥敏紙片均勻粘貼，37℃培養(yǎng)16～18 h，判定結果。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果

從病料中共分離出81株疑似大腸桿菌菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上為表面光滑、濕潤、邊緣波狀或整齊、微凸起的紅色菌落；伊紅美藍培養(yǎng)基上為紫黑色帶金屬光澤圓形菌落。革蘭氏染色呈陰性，其形態(tài)為桿狀，兩頭鈍圓，成對或散在分布。其結果與大腸桿菌的菌落特征、革蘭氏染色和形態(tài)相吻合。

2.2 生化試驗結果

81株分離菌株均能分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，靛基質試驗和MR試驗呈陽性，尿素酶試驗、V-P試驗、明膠液化試驗和枸櫞酸鹽利用試驗均呈陰性，試驗結果與大腸桿菌生化特性一致，為大腸桿菌。

2.3 致病性試驗結果

結果表明48 h內(nèi)有78個試驗組小白鼠發(fā)病且死亡，其余3個試驗組和對照組的小白鼠均健康存活。死亡小白鼠剖檢均見腸管臌脹，腸腔內(nèi)有水樣稀便，肝臟腫大，心包淤血增厚。經(jīng)臟器劃線接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，進行桿菌的分離鑒定，結果與接種細菌相同。表明經(jīng)分離純化和生化鑒定的81株分離菌株中有78株為致病性大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結果

由表1可知，對78株致病性大腸桿菌進行的耐藥性檢測結果表明，對美羅培南和頭孢他啶敏感的菌株較多，分別占分離菌株的83.3%和66.7%；對氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異惡唑、復方新諾明、氟苯尼考、大觀霉素和氧氟沙星等耐藥的菌株較多，均達65%以上，其中對氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異惡唑和復方新諾明的耐藥菌株最多，分別達96.2%、96.2%、94.9%和93.6%。結果顯示，關中地區(qū)豬大腸桿菌對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，且耐藥性強，耐藥譜廣。

表1 致病性大腸桿菌對16種抗菌藥物的耐藥性檢測結果

3 討論

近年來，由于養(yǎng)豬場濫用或不合理使用抗生素，使大腸桿菌對抗生素的敏感性不斷下降，原因主要是由于其耐藥性經(jīng)耐藥質粒的轉移而擴散[4]。筆者試驗對分離鑒定的78株致病性大腸桿菌進行16種抗菌藥物的敏感性試驗，結果表明分離菌株對美羅培南和頭孢他啶等抗菌藥物較敏感，對氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異惡唑、復方新諾明、氟苯尼考、大觀霉素和氧氟沙星等藥物產(chǎn)生了較強耐藥性。且分離菌株對不同抗生素均具有多重耐藥性，表明關中地區(qū)豬大腸桿菌的耐藥性強、耐藥譜廣，這可能與本地區(qū)豬場長期將抗生素作為飼料添加或盲目采用抗生素治療腹瀉有關。

與國內(nèi)其他地區(qū)大腸桿菌的耐藥性相比，馮世文等對廣西省不同地區(qū)豬場分離的豬大腸桿菌進行體外藥敏試驗，結果顯示分離菌株對頭孢西丁、阿米卡星和壯觀霉素敏感率較高[5]。曾博等在我國西南地區(qū)61個不同規(guī)模化豬場中分離的大腸桿菌菌株進行18種藥物的藥敏試驗，結果顯示分離菌株對頭孢噻呋、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸相對敏感[6]。郭瀟木等對廣東地區(qū)264株大腸桿菌菌株進行18種抗菌藥物敏感性的測定，結果顯示分離菌株對黏菌素、頭孢他啶和阿米卡星較敏感[7]。王紅寶等對山西省80多個養(yǎng)豬場(戶)分離的97株大腸桿菌菌株進行26種抗生素敏感性試驗，結果表明分離菌株對頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮、頭孢噻肟和磷霉素4種抗生素高度敏感[8]。曹敏等對貴州省4個地區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖場分離的164株大腸桿菌菌株進行藥物敏感性試驗，結果顯示分離菌株對金霉素和氟苯尼考較敏感[9]。綜上所述，不同地區(qū)豬大腸桿菌對相關抗菌藥物的敏感性有很大不同，這可能與當?shù)爻Ｓ每股夭煌嘘P。

總之，大腸桿菌作為動物腸道存在的正常菌群，在環(huán)境條件改變或其他病原微生物感染后易繼發(fā)仔豬發(fā)生大腸桿菌病，由于其抗原復雜、血清型多、易產(chǎn)生耐藥性，且不同地區(qū)還可能存在不同的耐藥譜，給臨床防控本病帶來了很大的困難。因此，本病應根據(jù)當?shù)刂虏⌒源竽c桿菌的血清型研制針對性的疫苗進行預防，還應根據(jù)當?shù)刂虏⌒源竽c桿菌的藥物敏感性結果和耐藥譜，選取合適抗菌藥物進行防治，同時注意要交替和規(guī)范使用抗菌藥物，以達到更好地防控本病發(fā)生，減少經(jīng)濟損失，并降低因濫用或不合理使用抗生素對人類健康造成的危害。