連翹果實連翹酯苷提取及復(fù)配保鮮噴灑液應(yīng)用研究

毛若冰，張曉虎，謝 倩，何 勇

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

連翹為木犀科連翹屬植物連翹(Forsythiasuspense(Thunb.)Vahl)的干燥果實，產(chǎn)地集中在中國陜西、山東、河南、河北、四川等省份。商洛市位于陜西省東南部，地處秦嶺山地，連翹資源豐富，是該市重點發(fā)展的“五大商藥”之一[1]。連翹屬性苦微寒，在我國民間藥用歷史悠久，作為中國傳統(tǒng)中藥，經(jīng)常在臨床上被使用，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效[2,3]。連翹具有廣譜消炎抗菌作用，對金黃色葡萄球菌等致病菌的殺菌作用極強(qiáng)，對流感病毒和真菌也有一定的抵抗作用[4～6]。連翹主要成分有連翹酚、熊果酸、松脂素、齊墩果酸、白樺脂酸、黃酮醇甙類等。

連翹酯苷是連翹中的主要抗菌活性成分之一，能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞因子發(fā)揮免疫作用，并且具有高效抗氧化功能[7,8]。連翹酯苷提取物作為一種天然防腐物質(zhì)，對環(huán)境中常見腐敗菌的繁殖有較強(qiáng)的抑制作用。邱智軍等人[9]的研究結(jié)果表明連翹酯苷對油脂的抗氧化作用比連翹苷等其他活性組分更為顯著。連翹酯苷可廣泛應(yīng)用于生鮮食品保鮮等方面，延長食品的保質(zhì)期，有希望能夠開發(fā)成為一種成本較低的并且安全環(huán)保的新型食品防腐產(chǎn)品[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 連翹果實(2017年9月采摘于陜西省商洛市商州區(qū)丹江公園)、成熟圣女果(2018年4月采摘于商州區(qū)佳騫現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園)、泡沫包裝盒(一次性)、PE 保鮮膜(厚度0.11 mm)、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.2 試劑 連翹酯苷標(biāo)品(購于陜西省西安晶博生物科技公司)、95%無水乙醇、80%甲醇(分析純)、蒸餾水、氯化鈣、檸檬酸、植酸(食品級)。

1.1.3 菌種 革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌。

1.1.4 儀器設(shè)備 數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)、高速離心機(jī)(TG16-WS型，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)、果實硬度計(GY-3型，上海精密儀器儀表有限公司)、電子天平(FA3204B型，上海精科實業(yè)有限公司)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A(101)型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(LRH-70F，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)、多用粉碎機(jī)(HK-430型，杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司)、紫外可見分光光度計(cary100/300型，深圳海瑞斯自動化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將采摘的連翹果實在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，粉碎后過40目篩密封于干燥的廣口瓶內(nèi)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制備連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用蒸餾水定容至50 mL容量瓶內(nèi)搖勻，得到0.1 mg·mL-1的連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確吸取0.1 mg·mL-1連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL以80%甲醇定容于100 mL容量瓶內(nèi)搖勻，分別得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1濃度連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不加連翹酯苷的溶液作為對照。利用紫外分光光度計于波長266 nm處測不同濃度連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，每個樣品測定3組平行并取平均值。以連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以所測吸光度為縱坐標(biāo)，得到連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 連翹果實連翹酯苷的提取及測定 精確稱取0.5 g連翹果實粉末，按一定料液比加入不同濃度的乙醇溶液，并且控制提取時間和溫度，選擇一定的超聲功率提取。提取完成后置于高速離心機(jī)在轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1下分離5 min，獲上清液即連翹果實連翹酯苷的提取液。吸取連翹酯苷提取液1 mL，定容于10mL容量瓶內(nèi)搖勻。然后吸取1.0 mL定容于25 mL容量瓶中，在266 nm處測定吸光度(若吸光度值不在連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)可進(jìn)行稀釋)，重復(fù)3次取平均值，結(jié)合回歸方程計算連翹酯苷提取率。計算公式如下：

式中：W%—連翹果實連翹酯苷提取率%；C—連翹酯苷質(zhì)量濃度(含量)mg·mL-1；n—稀釋倍數(shù)；V—連翹酯苷提取液體積mL；M—連翹果實粉末質(zhì)量mg。

1.2.4 單因素實驗 分別探討提取時間(20、30、40、50、60 min)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(40、50、60、70、80%)、提取溫度(40、50、60、70、80℃)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、超聲功率(100、150、200、250、300 W)五個因素對連翹果實連翹酯苷提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以連翹果實連翹酯苷提取率為響應(yīng)值，選取3個影響顯著的因素，以單因素實驗最適條件的數(shù)值為中心點，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗，利用Design-Expert8.0.6軟件對提取條件進(jìn)行數(shù)學(xué)建模，得到最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.2.6 抑菌實驗設(shè)計 分別取活化后的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌接入無菌水中，制備濃度為1×105 cfu·mL-1的菌懸液備用。將待試菌懸液各取0.1 mL加入到牛肉膏蛋白胨瓊脂平板培養(yǎng)皿中，涂布均勻。將連翹酯苷配制成100、50、25、12.5、6.25 mg·mL-1五個濃度梯度(每個濃度做3組平行)。將直徑為6 mm的濾紙片120℃干熱滅菌2 h后完全浸漬于各濃度提取液中，經(jīng)干燥后放入含菌培養(yǎng)基表面中央，以無菌水為空白對照，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出觀察，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.7 保鮮噴灑液的篩選及保鮮實驗設(shè)計 選用氯化鈣、植酸、檸檬酸及連翹酯苷提取物作為防腐保鮮噴灑液配方的組分[11,12]，設(shè)計成4因素3水平的實驗處理，見表1。

表1 保鮮噴灑液配方篩選實驗設(shè)計

防腐保鮮效果實驗設(shè)計：每組取新鮮成熟圣女果0.5 kg用噴灑液進(jìn)行噴灑處理，置于一次性泡沫包裝盒中，用保鮮膜密封，于溫度25℃、濕度65%條件下貯藏，分別于2、4、6、8、10 d后觀察測定相關(guān)指標(biāo)，選擇最佳組合，重復(fù)實驗兩次。測定項目與計算方法如下：

爛果率%=(腐爛圣女果個數(shù)/圣女果總個數(shù))×100%；

失重率%=[(圣女果貯前質(zhì)量—圣女果貯后質(zhì)量) /圣女果貯前質(zhì)量]×100%；

果實硬度測定方法：用果實硬度計對貯后圣女果進(jìn)行硬度測定，每個樣品測定三次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=6.5003X+0.0068，R2=0.9986。

圖1 連翹酯苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 提取時間對連翹果實連翹酯苷提取率的影響 提取時間對連翹果實連翹酯苷提取率的影響見圖2。表明隨著時間的增加，連翹酯苷物質(zhì)不斷被提取，提取率增大；當(dāng)時間為50 min時連翹酯苷提取率達(dá)到最高，為5.63%；時間超過50 min時，連翹酯苷細(xì)胞內(nèi)溫度升高及在空氣中暴露時間延長發(fā)生降解或縮合等反應(yīng)，提取率逐漸下降。因此50 min為較佳的提取時間。

圖2 提取時間對連翹果實連翹酯苷提取率的影響

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對連翹果實連翹酯苷提取率影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對連翹果實連翹酯苷提取率影響見圖3。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)由40%提高到60%時，連翹酯苷提取率逐漸增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，連翹酯苷提取率最高，為5.41%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，溶液極性增強(qiáng)，導(dǎo)致連翹酯苷溶解度降低，提取率減小。因此60%為較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對連翹果實連翹酯苷提取率的影響

2.2.3 提取溫度對連翹果實連翹酯苷提取率的影響 提取溫度對連翹果實連翹酯苷提取率的影響見圖4。表明溫度增高時，分子運動速度加快，易于連翹酯苷溶出，提取率增大；溫度為50℃時提取率最高，為5.39%；當(dāng)提取溫度繼續(xù)增高，連翹酯苷受熱降解，提取率降低。因此50℃為較佳的超聲提取溫度。

圖4 提取溫度對連翹果實連翹酯苷提取率的影響

2.2.4 料液比對連翹果實連翹酯苷提取率的影響 料液比對連翹果實連翹酯苷提取率的影響見圖5，連翹果實連翹酯苷提取率隨著料液比的增大先增后減，隨著溶劑量的增大，溶解度增大，在較短時間內(nèi)與大量溶劑充分反應(yīng)；連翹酯苷提取率最高為5.61%；料液比主要影響傳質(zhì)推動力，大量的溶劑會影響提取體系的傳質(zhì)和傳熱，不利于提取的進(jìn)行。因此1∶15為較佳的料液比。

圖5 料液比對連翹果實連翹酯苷提取率的影響

2.2.5 超聲功率對連翹果實連翹酯苷提取率的影響 超聲功率對連翹果實連翹酯苷提取率的影響見圖6。表明超聲功率增大時，連翹酯苷提取率增加，原因是超聲波的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械作用，可以有效地破壞細(xì)胞壁，促使連翹酯苷快速大量溶出；功率為150 W時，提取率最高為5.56%；當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大時，超聲波的熱效應(yīng)使連翹酯苷分解，提取率下降。因此150 W為較佳輔助功率。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面因素及水平的確定 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為50℃，選取對連翹果實連翹酯苷物質(zhì)提取率影響較大的料液比、提取時間、超聲功率3個因素，確定響應(yīng)面因素水平。響應(yīng)面實驗因素及水平見表2。

圖6 超聲功率對連翹果實連翹酯苷提取率的影響

因素水平-101A料液比/(g∶mL)1∶101∶151∶20B提取時間/min405060C超聲功率/W100150200

2.3.2 響應(yīng)面實驗方案與結(jié)果 以連翹果實連翹酯苷提取率為A、B、C三個因素的響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面對連翹果實連翹酯苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化實驗。在17個實驗組合條件下，實驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗方案與結(jié)果

2.3.3 回歸分析 以A料液比，B提取時間，C超聲功率為自變量，連翹果實連翹酯苷的提取率W為數(shù)學(xué)建模的響應(yīng)值，利用軟件對表4中的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[13]，得到二次多元回歸方程模型為：

W=5.84+0.096*A+0.15*B-0.39*C+0.079*AB-0.27*AC-0.10*BC-0.64*A2-0.58*B2-0.72*C2

該方程中各項系數(shù)的正、負(fù)值反映了各因素對響應(yīng)值的影響方向，絕對值大小反映影響程度[14]。從方程的一次項系數(shù)的絕對值大小，看出影響連翹酯苷提取率因素的順序為：超聲功率>提取時間>料液比。該方程式的二次項系數(shù)均為負(fù)值，可推斷方程形成的拋物面開口向下，具有極大值點，能夠進(jìn)行優(yōu)化分析[15]。回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果見表4。

由表4可知，方程模型顯著性P<0.0001，極顯著，說明模型有意義。一次項中A、B、C和二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值影響均為顯著，交互項AB、AC、BC對響應(yīng)值的影響也為顯著，說明交互作用對響應(yīng)值影響較強(qiáng)。模型的失擬項P值僅為0.1411，說明擬合回歸方程符合實際情況，模型能較好地反映真實實驗值，可用此模型對連翹酯苷提取率進(jìn)行分析和預(yù)測[14,15]?；貧w模型方差分析見表5。

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果

表5 回歸模型方差分析

由表5可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，校正系數(shù)R2Adj=0.9996，表明該回歸模型可以解釋99.96%的響應(yīng)值變化，表明模型與實際情況擬合較好。變異系數(shù)C.V=0.29%，說明模型能較好地反映真實的實驗值，優(yōu)化提取工藝可以通過該方程來確定。

圖7 超聲時間和液料比的交互作用對連翹酯苷提取率影響的等高線

圖8 超聲時間和液料比交互作用對連翹酯苷提取率影響的響應(yīng)曲面

2.3.4 響應(yīng)面分析 由圖7、圖8可知，當(dāng)料液比一定時，連翹酯苷提取率隨著提取時間的增加而上升，當(dāng)超聲時間在48～54 min時，連翹酯苷提取率達(dá)到最大，隨著時間的延長，連翹酯苷提取率逐漸下降；當(dāng)提取時間一定時，隨著料液比的增加，連翹酯苷提取率先上升后降低，約在料液比為1∶14～1∶16 g·mL-1時，連翹酯苷提取率達(dá)到最大。結(jié)果表明，超聲時間、料液比二者的交互影響對連翹酯苷提取率的影響較小。由此可知，合適的料液比對獲得較高的連翹酯苷提取率較為重要。

圖9 超聲功率和液料比交互作用對連翹酯苷提取率影響的等高線

由圖9、圖10可知，當(dāng)超聲功率一定時，料液比在1∶14～1∶16 g·mL-1時，連翹酯苷提取率逐漸增加，之后隨著料液比的增加提取率逐漸下降；當(dāng)料液比一定時，可得到較高連翹酯苷提取率的超聲功率為125～175 W，之后連翹酯苷提取率會隨超聲功率的提高而降低。由此可知，合適的超聲功率和料液比對連翹酯苷提取率均比較重要[16]。

由圖11、圖12可知，當(dāng)提取時間一定時，超聲功率125～175 W左右連翹酯苷提取率較高；當(dāng)超聲功率一定時，提取時間在45～55 min時，連翹酯苷提取率較高。因此可知，在實驗水平范圍內(nèi)，延長提取時間在適宜的超聲功率下可獲得較高的連翹酯苷提取率。

2.4 抑菌實驗結(jié)果分析

圖10 超聲功率和液料比交互作用對連翹酯苷提取率影響的響應(yīng)曲面

圖11 超聲功率和超聲時間交互作用對連翹酯苷提取率影響的等高線

圖12 超聲功率和超聲時間的交互作用對連翹酯苷提取率影響的響應(yīng)曲面

供試菌種不同濃度提取物的抑菌圈直徑/mm100/(mg·mL-1)50/(mg·mL-1)25/(mg·mL-1)12.5/(mg·mL-1)6.25/(mg·mL-1)0/(mg·mL-1)?金黃色葡萄球菌17.812.68.16.34.70枯草芽孢桿菌15.110.36.84.74.10大腸埃希氏菌14.39.15.44.63.40

由表6可知，連翹酯苷提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌均有抑制效果，抑菌效果為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸埃希氏菌，濃度為100 mg·mL-1的連翹酯苷提取物對金黃色葡萄球菌最大抑菌直徑為17.8 mm。

2.5 最佳復(fù)配保鮮噴灑液的篩選及保鮮實驗結(jié)果分析

由表7可見，在常溫下隨著時間的增加，不同配方組合的噴灑液處理的圣女果爛果率均為上升趨勢。結(jié)果表明：觀察期內(nèi)(10 d)第3配方組合處理的圣女果爛果率最低僅為26.79%。

由表8可見，隨著時間的增加，不同配方組合的噴灑液處理的圣女果失重率均呈現(xiàn)上升趨勢。結(jié)果表明：保藏期內(nèi)(10 d)第3配方組合處理的圣女果失重率最低僅為2.96%。

由表9可見，在常溫下隨著時間的增加，不同配方組合的噴灑液處理的圣女果硬度均為下降趨勢。結(jié)果表明：保藏實驗期內(nèi)(10 d)第3配方組合處理的圣女果硬度最大約為0.68 mg·cm2。

表7 不同配方組合對圣女果爛果率的影響結(jié)果 (%)

表8 不同配方組合對圣女果失重率的影響結(jié)果 (%)

表9 不同配方組合對圣女果硬度的影響結(jié)果 (mg·cm2)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)響應(yīng)面實驗得到的優(yōu)化提取條件為：提取時間50 min、超聲功率150 W、超聲溫度50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶15。影響連翹果實連翹酯苷提取率的順序為：超聲功率>提取時間>料液比。

(2)抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸埃希氏菌，濃度為100 mg·mL-1的連翹酯苷提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為17.8 mm。

(3)最佳連翹酯苷復(fù)配保鮮噴灑液配方為：2%連翹酯苷提取物+1%氯化鈣+0.15%植酸+2%檸檬酸，對圣女果保鮮效果良好，并可適當(dāng)延長保藏時間。

3.2 討論

(1)張曉虎等[10]研究表明甲醇浸提連翹酯苷的提取率最高為6.668%，乙醇浸提連翹酯苷的提取率最高為5.916%。連翹果實的最佳采摘期一般在8月份左右，連翹酯苷含量較高，采摘過早或過晚連翹酯苷含量都會有所降低。筆者用乙醇為提取溶劑的原因是實驗以圣女果為保鮮應(yīng)用對象，而甲醇具有毒性不宜采用。

(2)筆者采用超聲輔助乙醇提取連翹果實中的連翹酯苷，利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械作用和熱效應(yīng)加速溶劑進(jìn)入固體物質(zhì)，從而快速提取目標(biāo)物質(zhì)。與其他溶劑提取法比較，超聲輔助提取不但可以節(jié)省時間和減少能耗，而且避免高溫影響有效成分。

(3)響應(yīng)面法通過分析實驗值，建立比較符合實際情況的模型，相比其他方法可以更加直觀準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方便優(yōu)化工藝條件，得到較為精確的最優(yōu)工藝參數(shù)，可節(jié)約生產(chǎn)成本[14,15]。

(4)商洛地區(qū)連翹資源豐富，亟待綜合開發(fā)利用，連翹酯苷提取物能有效抑制環(huán)境中常見腐敗菌的繁殖，可作為天然防腐成分延長食品的保質(zhì)期，極具潛力開發(fā)成為新型食品防腐劑。