無抗日糧背景下對四種常見益生菌制劑的評估

◆作者：魏可健 舒丹平 周琪琪 曾得壽 譚現(xiàn)義 劉緒同 劉煬

◆單位：深圳市金新農(nóng)科技股份有限公司，深圳，518106

幾十年來，抗生素已廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)，據(jù)報道，中國抗生素的使用量和排放量遠遠高于歐美發(fā)達國家，其中動物用抗生素占總量的52%。由于大量使用抗生素引發(fā)了藥物殘留、抗生素耐藥性、環(huán)境污染等問題，歐盟委員會于2006年已禁止在飼料中添加抗生素作為生長促進劑。美國也在消費者壓力的推動下逐漸淘汰促生長用抗生素的使用（Castannon，2007）。隨著禁抗的步伐不斷加速，研究探索新的抗生素替代品已成為迫在眉睫的需求。

益生菌制劑是一種含有單一或混合活菌的添加劑，當攝入有效劑量的益生菌制劑會對機體產(chǎn)生有益的作用。益生菌廣泛用于食品行業(yè)和動物生產(chǎn)中，其主要成分活菌能夠在腸道內(nèi)定植，抑制有害菌的生長繁殖，促進腸道的微生態(tài)平衡。其代謝產(chǎn)物還能夠調(diào)節(jié)腸道免疫，維持腸道的正常功能，使機體的免疫能力增強，提高腸道對食物的消化率。已發(fā)表的研究結(jié)果表明益生菌對動物生長性能的促進作用存在較大的差異，可能是由于益生菌的使用劑量、益生菌類型、使用時間、飼料穩(wěn)定性及理化性質(zhì)和養(yǎng)殖管理等因素的影響。在商業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用的益生菌制劑有:乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳球菌屬、酵母菌屬和芽孢桿菌屬。其中芽孢桿菌屬、腸球菌屬和酵母菌屬是動物養(yǎng)殖中使用最普遍的益生菌屬。（Ferreira等，2011）由于益生菌制劑含有活菌的屬性，進入動物體消化道的過程中會被各種消化液作用而部分失活。且益生菌不能耐受過高的溫度，這也使得其在飼料生產(chǎn)中受到制約。因此，了解常見的益生菌制劑的生物活性對飼料生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的參考價值。試驗通過研究四種常見益生菌的耐高溫能力、耐胃酸和膽鹽能力和抑菌性，以求為更好地發(fā)揮益生菌制劑在飼料工業(yè)中的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 益生菌制劑

益生菌制劑包括枯草芽孢桿菌（≥1×1010CFU/mg）、地衣芽孢桿菌（≥1×1010CFU/mg）、丁酸梭菌（≥1.5×1010CFU/mg）和屎腸球菌（≥3×109CFU/mg）。

1.1.2 指示菌

大腸桿菌ATCC25922；沙門氏菌ATCC14028；產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固態(tài)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物 5g，氯化鈉 10g，瓊脂粉15g，加入1000mL H2O完全溶解后，調(diào)pH值至7.3±0.1，121℃滅菌20min。脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉10g，蒸餾水100ml，經(jīng)過115℃高壓蒸汽滅菌15min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉 3.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH 7.4±0.2，經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15min。

RCM培養(yǎng)基：牛肉浸出粉1.0g，胨 1.0g，酵母浸出粉 0.3g，可溶性淀粉0.1 g，葡萄糖0.5 g，鹽酸半胱氨酸 0.05g，NaCl 0.5g，乙酸鈉0.3g，瓊脂0.05g，蒸餾水100mL，調(diào)節(jié) pH 6.8±0.2，經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15min。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨 5.0g，酵母浸粉 2.5g，葡萄糖 1.0g，瓊脂 15.0g。

LB固體培養(yǎng)基：氯化鈉1g、蛋白胨1g、酵母浸提物0.5g、瓊脂粉1.5g、水100ml。調(diào)pH值為7.0±0.2。121℃，高壓 滅 菌15min，滅菌后可放置在80℃的水浴鍋或者烘箱中保溫。

蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH 7.0士0.2，經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 試驗器材

移液槍（槍頭）、牛津杯、培養(yǎng)皿、離心管、酒精燈、止血鉗、超凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、離心機、自動pH測定儀、高壓滅菌鍋、天平、滅菌器、培養(yǎng)皿、試管、燒杯、量筒、酒精燈、牛津杯。

1.2 試驗方法

1.2.1 高溫耐受性試驗

①菌液的制備：分別稱取1g樣品加入10 mL無菌水，震蕩混勻，備用。

②試驗方法：用平板計數(shù)法分別對四種益生菌制劑的起始菌液濃度進行計數(shù)。且按1%劑量將菌液加入含有80%甘油和20%無菌水的混合液，將處理液置于85℃的水浴鍋，水浴5 min。水浴結(jié)束，使用平板計數(shù)法對水浴處理后的菌液濃度進行計數(shù)。

1.2.2 胃酸和膽鹽耐受性試驗

①配置模擬胃液：用10M HCl將無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至pH=2.5，每100mL液體加入1g胃蛋白酶，混勻，用0.20μm的無菌濾頭過濾待用。

②配置模擬小腸液：用10M HCl將無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至pH=6.8，每100 mL液體加入1 g胰蛋白酶、0.3 g膽鹽，混勻，用0.20 μm的無菌濾頭過濾待用。

③試驗方法：按1%劑量將1.2.1中制備好的菌液加入10 mL模擬胃液中，于37℃水浴1h。在6000r/min條件下離心6min，去上清液，加入10mL無菌生理鹽水重懸，此步驟重復(fù)三次。將重懸后的菌液在6000rpm條件下離心6min，去上清液。加入10 mL制備好的模擬小腸液，于37℃水浴2h。水浴結(jié)束，使用平板計數(shù)法對處理后的菌液濃度進行計數(shù)。

1.2.3 牛津杯抑菌試驗

①菌種的活化：大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌為指示菌。分別對四種益生菌制劑和三種指示菌進行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落加入對應(yīng)的液體培養(yǎng)基進行擴增，于37℃培養(yǎng)48 h（丁酸梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧罐中培養(yǎng)），備用。

②固體培養(yǎng)基的配置：在已滅菌的培養(yǎng)皿中倒入15 mL LB固體培養(yǎng)基進行封底。待第一層培養(yǎng)基凝固。待LB固體培養(yǎng)基放置到不燙手后，每100mL LB固體培養(yǎng)基中，加入100uL菌液，混勻。倒入之前配置好的已經(jīng)凝固的培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基倒入5mL。

③試驗方法：將牛津杯放置于培養(yǎng)基5～10min后，待培養(yǎng)基凝固，用止血鉗取出牛津杯，在培養(yǎng)皿底部寫好記號，對應(yīng)沿圓環(huán)外壁均勻加入10uL樣品溶液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（丁酸梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧罐中培養(yǎng)）。

2 試驗結(jié)果

2.1 高溫的耐受性試驗

由表1可知，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對高溫均有較高的耐受性，在85℃水浴5 min后細菌存活率均高于80%。而屎腸球菌對高溫的耐受能力較弱，經(jīng)過高溫水浴后存活率僅不到5%。

表1 益生菌制劑對高溫的耐受性

表2 益生菌對胃酸和膽鹽的耐受性

2.2 胃酸和膽鹽的耐受性試驗

由表2可知，經(jīng)過處理后的枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌的存活率均大于90%，試驗表明枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對胃酸和膽鹽的耐受力較強。地衣芽孢桿菌對胃酸和膽鹽的耐受能力相較枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌稍弱，但強于屎腸球菌，細菌存活率達到72.94%。屎腸球菌經(jīng)過胃酸和膽鹽處理后細菌的細菌存活率只有30.53%。

2.3 牛津杯抑菌試驗

由表3可知，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌對大腸桿菌均無抑制作用；地衣芽孢桿菌可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長，而枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均沒有抑菌作用。屎腸球菌可以抑制沙門氏菌的生長，但對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌無抑菌效果。

3 討論

3.1 益生菌制劑對高溫的耐受性情況

益生菌制劑是一類生物活性添加劑，在畜產(chǎn)品安全和環(huán)境保護中發(fā)揮重要作用。但由于益生菌制劑的主要功能性物質(zhì)是活菌，在運輸、生產(chǎn)和貯存的過程中均存在失活的風險，所以產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定是益生菌制劑存在的主要問題之一（舒娜等，2003）。本試驗發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對高溫均有較好的耐受性，細菌存活率都達到80%以上。丁酸梭菌制劑中活菌是以芽孢形式存在的，在高溫環(huán)境具有很強的穩(wěn)定性；經(jīng)80℃熱處理30 min全部存活，經(jīng)100℃熱處理5 min后30%存活（易中華，2012）。芽孢特殊的生物構(gòu)造及其對熱應(yīng)激較完善的調(diào)節(jié)機制使芽孢菌耐熱性較強，與本試驗的結(jié)果基本一致。宋獻藝等（2018）的試驗發(fā)現(xiàn)屎腸球菌經(jīng)過80℃熱處理30 min后，存活率僅為17%。經(jīng)過80℃熱處理60min后無活菌存活。宋（2018）的研究表明屎腸球菌對高溫的耐受能力較弱，這一結(jié)果與本試驗結(jié)果基本一致。試驗結(jié)果提示益生菌制劑在飼料加工過程中應(yīng)優(yōu)先選擇對高溫耐受性較好的芽孢菌。而對于不耐高溫的益生菌，應(yīng)通過改良加工技術(shù)優(yōu)化其對環(huán)境的適應(yīng)能力。

表3益生菌制劑的抑菌作用效果

3.2 益生菌制劑對胃酸和膽鹽的耐受性情況

益生菌主要在動物的腸道中發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡，增強動物免疫能力，維持動物的健康狀態(tài)。胃液有強酸性且含有胃蛋白酶，而小腸中膽 鹽 濃 度 達 到 0.3%（w/v）。（Chou L等，1999）益生菌在消化道中需要經(jīng)歷2 h的低pH胃酸環(huán)境和小腸中高濃度的膽鹽環(huán)境（李善仁等，2010）。低pH條件或疏水條件會解離益生菌的膜蛋白，進而導(dǎo)致細胞死亡（宋獻藝等，2018）。本試驗的結(jié)果表明地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對胃酸和膽鹽均表現(xiàn)較好的耐受性，其中枯草芽孢桿菌的對胃酸和膽鹽的耐受力強于其他三種益生菌制劑，細菌存活率最高達到93.74%。李善仁等（2010）的試驗中3株枯草芽孢桿菌在0.3%膽鹽處理2 h細菌存活數(shù)略有下降，無顯著差異，與本試驗結(jié)果基本一致。屎腸球菌經(jīng)過胃酸和膽鹽處理后，活菌存活率僅為31.53%，相較于試驗中其他三種益生菌制劑耐受能力較弱。丁酸梭菌能夠耐受胃液、膽鹽和消化液（易中華，2012）。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌經(jīng)過1 h模擬胃液處理和2 h模擬小腸液處理后細菌存活率仍達到90.03%。試驗一定程度可以表明以芽孢形式存在的益生菌制劑經(jīng)過胃腸道更能保證活菌數(shù)量，從而能夠更好地發(fā)揮有益作用。

3.3 益生菌制劑的抑菌效果

抑菌性是益生菌的一個重要作用。益生菌能夠產(chǎn)生具有抑菌效果的酶類、酸類等生物活性物質(zhì)或通過競爭抑制病原菌的生長（郭志杰等，2010；吳惠芬等，2005）。本試驗以沙門氏菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌三種病原微生物作為指示菌驗證益生菌制劑的抑菌效果。結(jié)果表明丁酸梭菌對三種指示菌均無明顯的抑菌作用。枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和丁酸梭菌對大腸桿菌和沙門氏菌均無明顯的抑菌作用，但地衣芽孢桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出了抑菌效果。但李善仁等（2010）的試驗發(fā)現(xiàn)三株枯草芽孢桿菌對大腸桿菌和沙門氏菌均表現(xiàn)出來抑菌作用；張雪平等（2001）的研究表明丁酸梭菌能夠抑制腸內(nèi)致病性大腸桿菌、傷寒沙門氏菌等有害菌的生長繁殖。益生菌的抑菌效果存在不穩(wěn)定性，同時菌株或培養(yǎng)環(huán)境的差異、益生菌制劑的加工工藝均會影響試驗結(jié)果，具體機制仍需要進一步進行研究。本試驗中屎腸球菌對沙門氏菌具有抑菌作用。Simova等（2009）的研究發(fā)現(xiàn)從乳制品中分離的屎腸球菌在發(fā)酵中產(chǎn)生細菌素，可以抑制病原微生物的生長。夏玉等（2014）的研究表明屎腸球菌發(fā)酵乳對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑制作用，與本試驗的結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對高溫、胃酸和膽鹽均有較好的耐受性，而屎腸球菌的耐受能力較弱。

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌對大腸桿菌均無抑制作用。屎腸球菌可以抑制沙門氏菌的生長，地衣芽孢桿菌可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長。

參考文獻：（略）