環(huán)狀RNA在糖尿病中的研究進(jìn)展

劉婷婷，張海東，王 靜，謝俊豪，金百翰，黃 勤※

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200433； 2.解放軍72506部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，河南 駐馬店 463200)

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是長鏈非編碼RNA家族的新成員，已成為近年來RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。1976年，circRNA首次在植物類病毒中被發(fā)現(xiàn)[1]。最初研究者誤認(rèn)為circRNA是線性RNA異常剪接的副產(chǎn)品[2]。隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展，circRNA被證實(shí)在不同的物種和不同的細(xì)胞系中存在，并發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。2012年，Salzman等[3]基于高通量測序技術(shù)報(bào)道了80余個(gè)circRNA，隨后科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了大量circRNA。有研究證實(shí)circRNA參與心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。由于表達(dá)廣泛和疾病調(diào)控作用，circRNA被認(rèn)為是多種疾病的生物學(xué)標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。雖然circRNA相關(guān)研究日益增多，但其與糖尿病相關(guān)方面的研究較少。現(xiàn)結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究，對circRNA與糖尿病關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的形成機(jī)制與分類 與線性RNA的標(biāo)準(zhǔn)剪切模式不同，circRNA是通過非經(jīng)典剪接方式進(jìn)行反向剪接而成，形成機(jī)制主要分為外顯子環(huán)化和內(nèi)含子環(huán)化。外顯子環(huán)化存在兩種模型[5]：模型一為套索驅(qū)動環(huán)化即在前體信使RNA(pre-messenger RNA，pre-mRNA)轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生外顯子跳躍，進(jìn)而形成套索結(jié)構(gòu)，后者再通過自身剪接并切除內(nèi)含子序列，最終形成一個(gè)circRNA；模型二為內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化，是指在pre-mRNA中兩個(gè)相鄰的內(nèi)含子通過堿基反向互補(bǔ)配對而形成套索結(jié)構(gòu)后切除剩余內(nèi)含子，從而形成circRNA。Zhang等[6]認(rèn)為內(nèi)含子環(huán)化亦可作為circRNA的形成機(jī)制，即5′端剪接位點(diǎn)富含7個(gè)鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)核苷酸序列與3′端分支位點(diǎn)富含11個(gè)胞嘧啶(C)核苷酸序列共同構(gòu)成核心保守序列，該序列可避免circRNA內(nèi)含子套索結(jié)構(gòu)被去分支酶降解，從而形成完整的 circRNA。此外，多種RNA結(jié)合蛋白均會影響 circRNA 的形成，如盲肌蛋白(muscle blind protein,MBL)和Quaking蛋白可促進(jìn)circRNA形成，而作用于RNA的腺苷脫氨酶1則會對circRNA的形成產(chǎn)生抑制作用[7-8]。

由于circRNA可在基因組的任何區(qū)域形成，故可依據(jù)來源主要分為以下3類：①外顯子來源的circRNA，由外顯子序列組成，形成于外顯子編碼區(qū)，主要存在于細(xì)胞質(zhì)[9]；②內(nèi)含子來源的circRNA，由內(nèi)含子序列組成，通常源于pre-mRNA剪切，主要存在于細(xì)胞核[6]；③外顯子-內(nèi)含子共同來源的circRNA，由外顯子和內(nèi)含子序列共同組成，即在circRNA的形成過程中環(huán)化外顯子之間滯留有未被切除的內(nèi)含子，主要存在于細(xì)胞核[10]。

1.2 circRNA的生物學(xué)特征及功能

1.2.1 circRNA的生物學(xué)特征 隨著circRNA研究的逐步深入，目前報(bào)道其主要具有以下幾方面生物學(xué)特征。①分布廣泛且種類豐富：circRNA廣泛存在于多種真核生物且種類豐富。在人、鼠、酵母菌等多種真核細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有10萬種以上circRNA[11-12]，且某些circRNA的表達(dá)水平甚至可達(dá)到同一基因來源的線性異構(gòu)體10倍以上。②性質(zhì)穩(wěn)定且半衰期長：circRNA的結(jié)構(gòu)呈首尾相接的封閉環(huán)狀，且不具備游離的5′端和3′端，使其不易被核酸外切酶RNase R和分支酶降解，故具有更穩(wěn)定的生物學(xué)特性[6]。研究發(fā)現(xiàn)大部分circRNA的半衰期均大于48 h，遠(yuǎn)大于線性mRNA 10 h左右的半衰期[13]。③高度保守性：大多數(shù)物種具有高度保守性的circRNA序列。Werfel等[14]在研究人類、大鼠和小鼠的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其具有高度保守性的circRNA 序列含量可達(dá)10%左右。④時(shí)空特異性：circRNA在不同的組織器官或同一組織器官的不同發(fā)育時(shí)期，其種類和表達(dá)量具有顯著差異，即circRNA在生物發(fā)展過程中常表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性。Salzman等[15]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中觀察到胞質(zhì)分裂貢獻(xiàn)者1基因可高表達(dá)circRNA，而在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中則呈低表達(dá)甚至無表達(dá)。同樣，Pan和Xiong[16]發(fā)現(xiàn)在線蟲的卵母細(xì)胞有circRNA存在，而在其早期的胚胎細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。

1.2.2 circRNA的生物學(xué)功能 circRNA的功能主要包括circRNA的海綿樣吸附作用、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用、與RNA結(jié)合蛋白相互作用以及參與翻譯生成蛋白質(zhì)4個(gè)方面。

1.2.2.1 circRNA的海綿樣吸附作用 微RNA(microRNA,miRNA)是一類具有調(diào)控作用的非編碼RNA，可通過堿基互補(bǔ)配對的方式遏止靶基因mRNA翻譯或促進(jìn)靶基因mRNA降解，參與調(diào)控機(jī)體的發(fā)育過程。circRNA含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可作為競爭性內(nèi)源RNA，類似“海綿”高效吸附相應(yīng)的miRNA，從而減少miRNA對其靶基因mRNA的抑制，促進(jìn)靶基因的表達(dá)。小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as),又被稱為miR-7的circRNA海綿包含了至少70個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)。在人和小鼠腦組織中，CDR1as高表達(dá)時(shí)可通過競爭性結(jié)合吸附miR-7進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，間接導(dǎo)致miR-7靶基因的表達(dá)水平提高；反之，CDR1as低表達(dá)時(shí)則會導(dǎo)致miR-7靶基因表達(dá)水平降低[11]。與CDR1as不同，研究者發(fā)現(xiàn)來自同源域相互作用蛋白激酶3(Homo sapiens homeodomain interacting protein kinase 3，HIPK3)基因外顯子2的circHIPK3可作為多種miRNA的“海綿”[17]。雖然很多研究證實(shí)了海綿效應(yīng)，但也有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)circRNA不起miRNA海綿作用[18]。

1.2.2.2 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄作用 circRNA可通過順式調(diào)控作用影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。ciRNA通過結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ復(fù)合體，正向調(diào)節(jié)該酶的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)其親本基因表達(dá)[6]。外顯子-內(nèi)含子共同來源的circRNA可與U1小核核糖核蛋白結(jié)合形成外顯子-內(nèi)含子共同來源的circRNA-U1小核核糖核蛋白復(fù)合體，該復(fù)合體通過結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ從而發(fā)揮順式調(diào)控作用促進(jìn)其基因轉(zhuǎn)錄[19]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA也可作為反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)產(chǎn)生假基因，調(diào)控基因表達(dá)[20]。

1.2.2.3 與RNA結(jié)合蛋白相互作用 circRNA還可通過與多種RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，形成RNA蛋白復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。如circ-Foxo3能通過結(jié)合人DNA結(jié)合蛋白抑制劑1、抗應(yīng)激蛋白局部黏著斑激酶及人低氧誘導(dǎo)因子1α等多種蛋白，抑制其抗衰老和抗應(yīng)激作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[21]。circ-Foxo3還能與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(p21)相互作用，形成circ-Foxo3-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2-p21三元復(fù)合物，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[22]。Ashwal-Fluss等[23]研究發(fā)現(xiàn)MBL可環(huán)化形成circMBL，后者可通過其內(nèi)含子的MBL結(jié)合位點(diǎn)與MBL相互作用，抑制生成MBL mRNA而降低MBL蛋白水平。

1.2.2.4 參與翻譯生成蛋白質(zhì) 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為circRNA是非編碼RNA。但近年來有大量報(bào)道顯示circRNA也具有翻譯生成蛋白質(zhì)的功能[24-26]。Chen和 Sarnow[24]研究發(fā)現(xiàn)circRNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)時(shí)，真核細(xì)胞核糖體就能啟動翻譯。如丁型肝炎病毒的單鏈circRNA能夠翻譯出與病毒相關(guān)的蛋白，且與肝炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[25]。此外，circRNA還通過滾環(huán)擴(kuò)增的機(jī)制翻譯蛋白且增加其表達(dá)水平[26]。

2 circRNA與胰島β細(xì)胞

胰島β細(xì)胞功能受損是2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)發(fā)病的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)miR-7可在胰島β細(xì)胞中過表達(dá)，并且通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路損傷胰島β細(xì)胞的去分化功能，抑制胰島β細(xì)胞增殖，減少胰島素的分泌，從而誘發(fā)糖尿病[27]。Hansen等[11]認(rèn)為CDR1as過表達(dá)時(shí)可通過海綿樣吸附miR-7而負(fù)向調(diào)控miR-7，阻礙miR-7對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的抑制作用，刺激胰島β細(xì)胞增殖，使胰島素分泌水平增加。Xu等[28]利用毛喉素和佛波酯長期刺激胰島β細(xì)胞使CDR1as含量增加，抑制miR-7活性并上調(diào)miR-7的靶基因Pax6和Myrip的表達(dá)，而兩者可增強(qiáng)胰島素基因轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)胰島素顆粒運(yùn)輸，促使胰島素分泌水平增加，提示CDR1as/miR-7可能成為治療糖尿病的新靶點(diǎn)。Stoll等[29]運(yùn)用微陣列方法檢測糖尿病模型小鼠的胰島β細(xì)胞中circRNA的表達(dá)水平及其作用機(jī)制，結(jié)果顯示circHIPK3在小鼠的胰島中表達(dá)下調(diào)，并導(dǎo)致β細(xì)胞擴(kuò)增減少和胰島素分泌降低，其機(jī)制可能與circHIPK3通過競爭性結(jié)合miR-338-3p和miR-124-3p以及調(diào)控β細(xì)胞關(guān)鍵基因(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2、肌侵蛋白和蛋白激酶B1)的表達(dá)有關(guān)，而上述這些miRNA可能在胰島β細(xì)胞發(fā)育、增殖和功能中發(fā)揮重要作用。由此表明，circHIPK3可能是調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能活性的新分子。Kaur等[30]發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞中顯著上調(diào)的circRNA包括轉(zhuǎn)化生長因子-βⅢ型受體和組蛋白去乙酰化酶9，其中轉(zhuǎn)化生長因子-βⅢ型受體因子參與編碼轉(zhuǎn)化生長因子-βⅢ型受體，而轉(zhuǎn)化生長因子-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)人胰島和成年小鼠的β細(xì)胞復(fù)制，提示circRNA在調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的功能中起重要作用。

3 circRNA與糖尿病的相關(guān)研究進(jìn)展

我國糖尿病患者約有4 000萬，其中T2DM約占90%[31-32]。T2DM是由于胰島素分泌絕對或相對不足，或者靶細(xì)胞對胰島素敏感性降低，造成糖代謝紊亂的一種慢性綜合性疾病，其晚期發(fā)生并發(fā)癥的概率較高，極易出現(xiàn)心腦血管病變、視網(wǎng)膜病變、末梢神經(jīng)炎及糖尿病腎病等多種疾病。circRNA在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用，可能作為糖尿病診斷與治療的潛在生物標(biāo)志物。

3.1 circRNA與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系

3.1.1 circRNA與糖尿病心腦血管病變 糖尿病患者常伴有高血壓、血脂紊亂等心腦血管病變的重要危險(xiǎn)因素，與非糖尿病人群相比，糖尿病患者發(fā)生心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。糖尿病合并心腦血管病變主要是動脈粥樣硬化，如冠狀動脈粥樣硬化引起心肌梗死、心絞痛、心力衰竭和猝死；腦動脈硬化引起缺血性發(fā)作、腦梗死。研究發(fā)現(xiàn)circRNA與和T2DM患者的冠狀動脈疾病的發(fā)生具有最強(qiáng)的相關(guān)性，研究人員將研究對象分為T2DM患者、冠心病患者、T2DM合并冠心病患者3個(gè)試驗(yàn)組和健康人群對照組，通過微陣列分析鑒定各組差異表達(dá)的40個(gè) circRNA，其中試驗(yàn)組中13個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，而27個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步篩選出顯著下調(diào)的Hsa_circ_11783-2并利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示Hsa_circ_11783-2與T2DM患者冠狀動脈疾病的發(fā)生關(guān)系密切[33]。Zhou和Yu[34]報(bào)道circRNA_010567在糖尿病小鼠心肌中表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究表明circ RNA_010567/miR-141/轉(zhuǎn)化生長因子-β1通路在糖尿病小鼠心肌纖維化的過程中起重要調(diào)節(jié)作用。此外，Tang等[35]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠心肌中表達(dá)上調(diào)的circRNA_000203，通過海綿吸附miR-26b-5p抑制其抗纖維化作用。

3.1.2 circRNA與糖尿病微血管病變

3.1.2.1 circRNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變 微血管病變是糖尿病的特異性并發(fā)癥，可累及全身各組織器官，其中以糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病尤為重要。目前有關(guān)circRNA與糖尿病微血管病變的研究集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變。Zhang等[36]研究證實(shí)Hsa_circ_0005015在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血漿、玻璃體標(biāo)本和視網(wǎng)膜內(nèi)皮血管膜中的表達(dá)明顯上調(diào)，并通過吸附miR-519d-3p抑制其功能，從而上調(diào)相關(guān)靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶-2、細(xì)胞X連鎖凋亡抑制蛋白和轉(zhuǎn)錄活化子3的表達(dá)。Shan等[37]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中circHIPK3顯著上調(diào)，其機(jī)制可能是circHIPK3抑制miR-30a-3p活性，調(diào)節(jié)下游基因血管內(nèi)皮生長因子C、卷曲蛋白4 和WNT2來影響糖尿病性視網(wǎng)膜病變，故認(rèn)為抑制circHIPK3可能減少視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏和炎癥，改善視網(wǎng)膜血管功能障礙，表明circHIPK3是減輕糖尿病相關(guān)視網(wǎng)膜病變的潛在治療靶點(diǎn)。此外，研究人員首次揭示了高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)circWDR77/miR-124-成纖維細(xì)胞生長因子2 調(diào)節(jié)通路在血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中起作用，為糖尿病微血管病變提供了新的理論依據(jù)[38]。

3.1.2.2 circRNA與糖尿病腎病 我國20%～40%的糖尿病患者合并糖尿病腎病，現(xiàn)已成為慢性腎臟病和終末期腎病的主要原因[39]。Hu等[40]發(fā)現(xiàn)circRNA_15698/miR-185/轉(zhuǎn)化生長因子-β通路促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成，為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供了新思路。但circRNA與糖尿病腎病方面相關(guān)報(bào)道較少，需要進(jìn)一步深入研究。

3.1.3 circRNA與糖尿病周圍神經(jīng)病變 糖尿病周圍神經(jīng)病變是最常見的糖尿病并發(fā)癥之一，臨床常表現(xiàn)為神經(jīng)性疼痛，顯著降低了患者的生活質(zhì)量。Wang等[41]研究發(fā)現(xiàn)circHIPK3在鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清和背根神經(jīng)節(jié)中含量較高，并通過敲除糖尿病大鼠circHIPK3后發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-12和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)降低，大鼠神經(jīng)性疼痛明顯緩解。進(jìn)一步研究表明其機(jī)制可能是circHIPK3通過負(fù)向調(diào)節(jié)miR-124的表達(dá)發(fā)揮作用。研究人員通過鞘內(nèi)注射circHIPK3 shRNA緩解糖尿病大鼠的神經(jīng)性疼痛，并證明了該方法可能成為治療糖尿病神經(jīng)性疼痛的手段之一。

3.2 circRNA與糖尿病的診斷的關(guān)系 研究表明，circRNA可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，診斷和預(yù)測腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌代謝疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[4]。Zhao等[42]通過微陣列技術(shù)分析對比健康人群和T2DM患者外周血中的circRNA水平，結(jié)果顯示兩組共有489個(gè)circRNA的表達(dá)存在差異，其中T2DM組有78個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，411個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)，然后篩選出5個(gè)circRNA作為候選生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_0054633具有作為前驅(qū)糖尿病和T2DM的診斷生物標(biāo)志物的潛力。Fang等[43]研究發(fā)現(xiàn)circANKRD36在T2DM患者的外周血白細(xì)胞中高表達(dá)，推測其可能通過與miRNA(包括Hsa-miR-3614-3p、Hsa-miR-498和Hsa-miR-501-5p)相互作用參與T2DM的慢性炎癥相關(guān)途徑，提示circANKRD36可用于判斷T2DM患者是否存在潛在感染的生物標(biāo)志物。

4 小 結(jié)

近年來circRNA是非編碼RNA家族的研究熱點(diǎn)之一，其多種生物學(xué)功能正逐漸被人們所認(rèn)知。盡管越來越多的研究認(rèn)識到circrRNA在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，但目前對circRNA與胰島β細(xì)胞和糖尿病的研究仍處于探索階段，其更深層次的生物功能及分子機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。相信隨著RNA高通量技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對circRNA與糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系將會有更加透徹的認(rèn)識。circRNA也極有可能成為糖尿病診斷和預(yù)測的潛在生物標(biāo)志物之一，有助于糖尿病的診斷、預(yù)后和精準(zhǔn)治療。