微RNA與椎間盤(pán)退變：從機(jī)制向臨床轉(zhuǎn)化邁進(jìn)

邵 拓，胡宇航，張軒碩，沈洪濤，于占革

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科,哈爾濱 150001)

下腰痛作為現(xiàn)代社會(huì)最常見(jiàn)的疾患之一，已嚴(yán)重影響人們的工作和生活。病因?qū)W研究顯示，椎間盤(pán)退變及其繼發(fā)的病變是產(chǎn)生疼痛的主要原因[1]。對(duì)椎間盤(pán)退變疾病的治療方法目前僅局限于保守治療及外科手術(shù)干預(yù)等對(duì)癥治療，尚無(wú)有效的早期干預(yù)和延緩?fù)俗冞M(jìn)程的方法。因此，為了尋找良好的治療方式，探究其疾病發(fā)生的分子機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。微RNA(microRNA，miRNA)是一類短序列的RNA，主要通過(guò)作用于目標(biāo)RNA，降解或阻遏信使RNA的翻譯，使靶基因在細(xì)胞中差異性表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游通路的激活。隨著對(duì)miRNA研究的深入，椎間盤(pán)退變的分子機(jī)制得到了更詳盡的闡述。已有眾多研究報(bào)道m(xù)iRNA在神經(jīng)退行性疾病、骨關(guān)節(jié)退行性疾病中均發(fā)揮重要作用[2-3]，甚至可以成為調(diào)控腫瘤疾病進(jìn)程的靶點(diǎn)[4]，這種miRNA的腫瘤治療技術(shù)也已進(jìn)入臨床審核階段。提示應(yīng)用miRNA的可行性，研究者希望將此種療法應(yīng)用于椎間盤(pán)退變的領(lǐng)域，并進(jìn)行了大量研究，現(xiàn)對(duì)miRNA在椎間盤(pán)退變中的作用進(jìn)行綜述，同時(shí)指明進(jìn)一步向臨床成果轉(zhuǎn)化的方向。

1 miRNA調(diào)控髓核退變的分子機(jī)制

基因芯片對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA在退變的髓核細(xì)胞中的表達(dá)與正常髓核細(xì)胞中存在顯著差異，這些差異表達(dá)的miRNA通過(guò)調(diào)控其各自的上下游通路可能參與髓核細(xì)胞退變的進(jìn)程，調(diào)控通路多有交叉并行，構(gòu)建出一個(gè)龐大的miRNA調(diào)控網(wǎng)。而這些miRNA的作用多遵循已發(fā)現(xiàn)的幾種髓核退變機(jī)制學(xué)說(shuō)(表1)。

PI3K/AKT：磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B；casepase-3：胱天蛋白酶-3；MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；HOXA：同源異型盒A家族；ATG：自噬相關(guān)基因；PDCD：細(xì)胞程序性死亡因子；AP：核轉(zhuǎn)錄激活蛋白；PTEN:人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；IL：白細(xì)胞介素；pERK：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；cyclin：細(xì)胞周期蛋白；SOX：SRY相關(guān)同源盒；GDF：生長(zhǎng)分化因子；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；Chsy：硫酸軟骨素糖基轉(zhuǎn)移酶；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子；↑：上調(diào)；↓：下調(diào)；-：未知

1.1 調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡、增殖 凋亡增殖學(xué)說(shuō)認(rèn)為，髓核的凋亡導(dǎo)致椎間盤(pán)組織中髓核細(xì)胞的數(shù)量的減少，因此難以維持間盤(pán)結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而導(dǎo)致間盤(pán)退變[5]。但在退變?cè)缙?，為了補(bǔ)充丟失的細(xì)胞，髓核細(xì)胞發(fā)生異常增殖進(jìn)行自我修復(fù)[6]。當(dāng)增殖難以補(bǔ)充凋亡，發(fā)生失代償時(shí)，椎間盤(pán)退變程度將不斷加劇。因此，抑制髓核細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖可能延緩椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。

在對(duì)髓核退變相關(guān)miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，大多miRNA在退變的髓核中呈高表達(dá)，且對(duì)凋亡起促進(jìn)作用。如miR-210、miR-328-5p、miR-589-3p可以通過(guò)Fas通路、受體型酪氨酸蛋白激酶通路等促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡[7-9]。在另一方面，miR-125a、miR-129-5p等抑制髓核凋亡和自噬過(guò)程[10-11]，研究者還發(fā)現(xiàn)某些 miRNA，如miR-96可以促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖[12]。證明在髓核退變過(guò)程中，同時(shí)存在髓核細(xì)胞的凋亡和增殖，且隨著退變程度增加，凋亡和增殖也愈加活躍，相關(guān)miRNA的表達(dá)量也隨之增加或降低。而通過(guò)外源性調(diào)控以上這些miRNA的表達(dá)，可以間接增加髓核細(xì)胞增殖、減少凋亡，延緩椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。不過(guò)，也有研究顯示，損傷模型的髓核細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)上調(diào)，而進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)載體上調(diào)miR-27a時(shí)，卻引起磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路介導(dǎo)的凋亡減少[13]。這與以往的“凋亡等于退變”或“凋亡程度等于退變程度”的觀點(diǎn)不同，提示，在髓核退變進(jìn)程中，髓核細(xì)胞凋亡和自我保護(hù)性增殖的觸發(fā)或許都存在一個(gè)最低臨界點(diǎn)和最高峰值。但這種理論還需更多研究證實(shí)，而目前的退變凋亡學(xué)說(shuō)仍存在缺陷，需要進(jìn)一步的完善和補(bǔ)充。

1.2 通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)家族調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡 細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)失衡也是椎間盤(pán)退變的機(jī)制。細(xì)胞外基質(zhì)中主要含有MMP、崩解素、含凝血酶基序的金屬蛋白酶等分解因子，以及Ⅱ型膠原、糖苷類物質(zhì)等合成因子。正常情況下，分解與合成同時(shí)存在，互相形成穩(wěn)態(tài)，當(dāng)有外界因素影響時(shí)，分解因子增加而合成因子減少，造成了穩(wěn)態(tài)失衡，髓核靜水壓力下降，使脊柱的壓縮載荷無(wú)法平均分布，最終導(dǎo)致椎間盤(pán)退變[14]。

對(duì)比退變髓核與正常髓核進(jìn)行基因芯片發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的miRNA多數(shù)通過(guò)調(diào)控MMP蛋白家族發(fā)揮作用。如miR-132、miR-133a、miR-127-5p、miR-155、miR-210、miR-663b等，可通過(guò)其不同靶基因，最終作用于MMP-16、MMP-9、MMP-13、MMP-3、MMP-2來(lái)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)平衡，使之趨向于分解[15-20]。除miR-155和miR-663b為負(fù)向調(diào)控外，其余均為正向調(diào)控[20-21]。通過(guò)干擾RNA抑制這些miRNA的表達(dá)可減少M(fèi)MP的合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的分解，達(dá)到減緩間盤(pán)退變的效果。

針對(duì)miRNA的研究為將MMP作為調(diào)控髓核退變的目標(biāo)靶點(diǎn)提供了可行性證據(jù)，由于MMP具備酶的高效性，調(diào)控MMP的合成可最大化miRNA對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控效應(yīng)，為調(diào)控眾多MMP的功能提供了統(tǒng)一化解決模式，同時(shí)也鞏固了細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)學(xué)說(shuō)的地位。

1.3 調(diào)控炎癥因子的分泌 研究者認(rèn)為，開(kāi)始發(fā)生退變的髓核細(xì)胞會(huì)與免疫系統(tǒng)細(xì)胞一同分泌炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1α/β、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-17等，這些炎癥因子具有促進(jìn)髓核退變的作用[22]。miR-21和miR-27的上調(diào)都會(huì)增加炎癥因子的分泌[23-24]，而上調(diào)miR-146a卻可以通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子/核因子κB通路來(lái)減少退變髓核細(xì)胞中炎癥因子的分泌[25]。說(shuō)明通過(guò)調(diào)控miRNA來(lái)減少髓核細(xì)胞分泌炎癥因子可行，但以上miRNA能否對(duì)免疫細(xì)胞的分泌產(chǎn)生調(diào)控作用尚待研究。

2 miRNA多向調(diào)控退變機(jī)制

人們?cè)僭O(shè)椎間盤(pán)退變的上述3種機(jī)制(細(xì)胞增殖凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)及炎癥反應(yīng))是互相聯(lián)系，互相促進(jìn)的。凋亡的髓核細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)使免疫細(xì)胞趨化，進(jìn)而使細(xì)胞外基質(zhì)分解因子增加，分解產(chǎn)物進(jìn)一步促進(jìn)退化的椎間盤(pán)釋放趨化因子。趨化因子促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞激活并浸潤(rùn)退變的椎間盤(pán)組織，進(jìn)一步放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)髓核細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致椎間盤(pán)退變加速[26]。這形成了一個(gè)惡性循環(huán)，使髓核愈加退變，僅切斷其中一環(huán)難以完全阻遏此循環(huán)，但miRNA及其靶點(diǎn)具有多向調(diào)控功能，使同時(shí)調(diào)控多機(jī)制成為可能。

同一個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)控髓核細(xì)胞異常凋亡增殖和細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)兩種機(jī)制(如miR-210,miR-589-3p等)，miRNA的過(guò)表達(dá)會(huì)同時(shí)促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡和MMP分解Ⅱ型膠原，加快髓核退變[8,20]。除此之外，過(guò)表達(dá)miR-27或miR-21會(huì)在促進(jìn)炎癥因子釋放的同時(shí)促進(jìn)髓核細(xì)胞的異常增殖或凋亡[13,23-24]。當(dāng)miRNA受干擾后，相應(yīng)的凋亡增殖、基質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎癥因子釋放均得到抑制。miRNA的調(diào)控不僅具有多向性，還具有歸一性，雖然miRNA作用于不同的靶基因(P-p38、pERK1/2、GDF5)，但通過(guò)激活促分裂原活化的蛋白激酶通路，最終表現(xiàn)為炎癥因子的釋放量和MMP的生成量的同向增加或減少[15,24]。

miRNA加強(qiáng)了上述3種機(jī)制間的聯(lián)系，并在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控關(guān)系網(wǎng)，現(xiàn)今所探知的miRNA及其通路之間的互相作用關(guān)系只是其中一小部分，研究此關(guān)系網(wǎng)中的“樞紐”調(diào)控點(diǎn)將對(duì)未來(lái)選擇miRNA上下游調(diào)控的起點(diǎn)和靶點(diǎn)具有指導(dǎo)作用。同時(shí)，還有一部分miRNA的調(diào)控功能獨(dú)立于以上幾種主流機(jī)制之外，如抑制miR-194、miR-515會(huì)阻遏其靶基因硫酸軟骨素糖基轉(zhuǎn)移酶1/2/3 mRNA的翻譯，中斷下游硫酸軟骨素糖基轉(zhuǎn)移酶的合成，阻礙硫酸軟骨素的生成，使椎間盤(pán)細(xì)胞的生物骨架的穩(wěn)定性減弱，降低了椎間盤(pán)的負(fù)重強(qiáng)度、黏彈性等，從而促進(jìn)椎間盤(pán)退變[27]。還有研究表明，髓核退變與血管長(zhǎng)入相關(guān)，正常的髓核細(xì)胞能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而退變的髓核抑制效果降低[28]，使miR-21調(diào)控的血管內(nèi)皮的增殖和遷移增加[29]，促使微血管長(zhǎng)入髓核，破壞了椎間盤(pán)內(nèi)微環(huán)境。以上關(guān)于miRNA的研究，增加了研究者對(duì)椎間盤(pán)退變機(jī)制的認(rèn)知，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的分子機(jī)制具有重要引導(dǎo)意義。

3 miRNA在髓核退變中的應(yīng)用

3.1 退變模型的構(gòu)建

3.1.1 細(xì)胞水平退變模型構(gòu)建 現(xiàn)階段研究者對(duì)于有關(guān)髓核退變的miRNA研究多停留于細(xì)胞水平，但研究人員采用的退變髓核樣本不盡相同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不存在可比性。同是對(duì)于miR-21在髓核退變中作用的實(shí)驗(yàn)研究，腰椎間盤(pán)突出患者術(shù)中摘除的自然退變髓核細(xì)胞中miR-21的表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增高[30]，而在腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)退變的髓核細(xì)胞模型中，miR-21的表達(dá)量卻顯著低于正常對(duì)照組[31]，產(chǎn)生了完全相悖的結(jié)論。原因可能是體外建模的退變髓核細(xì)胞多處于退變前期，與已經(jīng)達(dá)到手術(shù)指征的患者樣本相比退變程度差異顯著。對(duì)于細(xì)胞水平的髓核退變程度，學(xué)者們多通過(guò)免疫熒光測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原含量予以衡量[20-22]，但目前尚缺乏統(tǒng)一性標(biāo)準(zhǔn)。體外促髓核細(xì)胞退變模型尚不能完全模擬體內(nèi)的自然退變水平，仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

3.1.2 動(dòng)物水平髓核退變模型構(gòu)建 盡管眾多學(xué)者對(duì)miRNA調(diào)控椎間盤(pán)退變的分子機(jī)制及其調(diào)控靶點(diǎn)已解釋得較為清楚，但這些研究卻大多局限于細(xì)胞水平，miRNA在椎間盤(pán)退變中的體內(nèi)應(yīng)用效果鮮有報(bào)道。報(bào)道過(guò)的動(dòng)物的椎間盤(pán)退變模型構(gòu)建方法主要包括：①利用特殊動(dòng)物沙鼠的自發(fā)性椎間盤(pán)退變模型[32]；②改變椎間盤(pán)力學(xué)環(huán)境的退變模型；③穿刺或穿刺抽吸髓核構(gòu)建的退變模型；④化學(xué)損傷造成的椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型；⑤基因敲除技術(shù)構(gòu)建的椎間盤(pán)退變模型[33]。這幾種方式各有其利弊，但綜合倫理學(xué)及可重復(fù)性和經(jīng)濟(jì)因素，應(yīng)用最廣的為椎間盤(pán)穿刺或穿刺髓核抽吸法。椎間盤(pán)穿刺法需要構(gòu)建的時(shí)間較長(zhǎng)(約4周)，椎間盤(pán)穿刺髓核抽吸法所需時(shí)間較短(約2周)，經(jīng)磁共振成像及病理學(xué)切片驗(yàn)證均可產(chǎn)生良好的誘發(fā)間盤(pán)退變效果[34]。所用動(dòng)物多為大鼠或新西蘭大白兔，動(dòng)物的性別可能是影響結(jié)果的變量之一，在研究中均給予控制。但在針對(duì)人的miRNA的研究中發(fā)現(xiàn)，性別并非是影響miRNA表達(dá)量的因素[35]。雄性大鼠的椎間盤(pán)穿刺模型是現(xiàn)在應(yīng)用較廣泛的椎間盤(pán)退變建模方案。

3.2 臨床應(yīng)用可行性及安全性 在椎間盤(pán)內(nèi)注射富集miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是已在小鼠體內(nèi)證實(shí)的可行miRNA體內(nèi)給藥方式，可充分發(fā)揮miRNA的延緩髓核退變功能[31]。除直接間盤(pán)注射外，將富集miRNA的外泌體經(jīng)皮穿刺椎弓根給藥或許是另一種體內(nèi)給藥方式，因?yàn)橛醒芯勘砻鞴撬栝g充質(zhì)細(xì)胞外泌體可以通過(guò)終板軟骨屏障[36]。諸如靜脈注射的其他給藥方式，雖在腫瘤治療方面取得一定成果，但在椎間盤(pán)退變領(lǐng)域尚無(wú)成功案例。

miRNA的多調(diào)控性在抑制髓核細(xì)胞凋亡的同時(shí)也可能會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[37]，以及加速阿爾茨海默病的發(fā)展[38]。這可能會(huì)限制miRNA在同時(shí)患有惡性疾病及阿爾茨海默病的椎間盤(pán)退變疾病患者中的應(yīng)用。為了了解miRNA在椎間盤(pán)退變患者中應(yīng)用的安全性，有必要進(jìn)一步驗(yàn)證其劑量對(duì)其他疾病發(fā)生發(fā)展的影響。同時(shí)，有研究表明，在椎間盤(pán)退變的患者中，外周血的miRNA表達(dá)量與正常人群存在顯著差異[39]。因此，在miRNA局部椎間盤(pán)內(nèi)給藥后測(cè)定靜脈血中的miRNA水平可能也是驗(yàn)證miRNA在體內(nèi)應(yīng)用的安全性的方法之一。

4 結(jié) 語(yǔ)

miRNA因具有多調(diào)控性、構(gòu)建簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，被認(rèn)為是未來(lái)延緩和治療髓核退變的重要靶點(diǎn)。在髓核細(xì)胞異常增殖和凋亡、調(diào)控細(xì)胞基質(zhì)外穩(wěn)態(tài)平衡以及調(diào)控髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)因子的分泌中均發(fā)揮重要的作用，但由于數(shù)量龐大，作用復(fù)雜，探究幾種機(jī)制的共調(diào)控miRNA是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

在今后進(jìn)行miRNA與髓核退變的研究時(shí)，應(yīng)采用患者術(shù)中摘取的髓核進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免細(xì)胞建模造成的退變程度不一致影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，由于miRNA具有促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移作用，在治療椎間盤(pán)退變的體內(nèi)研究中，探究給藥方式、劑量和安全性是進(jìn)一步臨床應(yīng)用的前提。如果有條件，對(duì)外周血中的miRNA表達(dá)量也應(yīng)加以定量。富集miRNA間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體椎間盤(pán)注射在椎間盤(pán)退變的臨床治療上已初見(jiàn)成效，或成為未來(lái)miRNA體內(nèi)給藥的主要途徑。綜上所述，miRNA對(duì)椎間盤(pán)退變疾病治療的應(yīng)用前景不可估量。