干眼的再生療法研究進展△

張夢瑤 汪水風(fēng) 邵毅

干眼(dry eye，DED)是一種以淚膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失為特征的眼表多因素疾病，伴有淚膜不穩(wěn)定性，且具有高滲性、眼表炎癥與損傷以及神經(jīng)感覺異常等[1]。DED的患病率為5%～50%[2]，女性和老年人的比例更高[3]。最近，Tear Film and Ocular Surface Society(TFOS)與國際干眼研討會( International Dry Eye Workshop，DEWS)一致認為，淚液高滲性和不穩(wěn)定性是其核心病因。其定義了2種主要的亞型：(1)蒸發(fā)性干眼(evaporative dry eye，EDE)，其中淚液高滲性是淚液在正常淚腺功能下過度蒸發(fā)的結(jié)果；(2)缺水性干眼(aqueous-deficient dry eye，ADDE)，其中高滲性是由正常淚液蒸發(fā)速率下淚液分泌減少引起的[4]。

DEWS委員會強調(diào)，高滲性和炎癥對干眼的影響很大[1]。在一些淚液分泌功能正常的情況下，淚膜功能差或淚液成分蒸發(fā)過多會導(dǎo)致淚膜滲透壓增加[5]，這會使眼表處于高滲狀態(tài)。DED患者中淚液滲透壓升高可誘導(dǎo)眼表炎癥。VanDerMeid等[6]發(fā)現(xiàn)淚液滲透壓升高與細胞因子[白細胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)]和基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9、10水平增加呈正相關(guān)。DED患者可出現(xiàn)結(jié)膜鱗狀上皮化生、杯狀細胞減少、上皮細胞凋亡增多，CD4+、CD8+T細胞及巨噬細胞角結(jié)膜浸潤增多[7]。淚腺發(fā)炎可能會產(chǎn)生含有粗鹽細胞因子的異常淚液，從而破壞眼表，激活血管和淋巴管生成，加重炎癥，導(dǎo)致眼表損傷、視力損傷和其他相關(guān)癥狀[4]。

目前，干眼無法治愈，其治療旨在改善癥狀，常規(guī)治療方法是應(yīng)用人造眼淚，抗炎和局部免疫抑制，可用于改善慢性炎癥的癥狀[4]。類固醇治療法是DED相關(guān)炎癥最常用的短期治療法，但不推薦長期使用[4]。環(huán)孢素A是

源自真菌的免疫抑制肽，用作DED治療的抗炎局部滴劑。由于近年來對DED的關(guān)注[4]，新的再生策略的出現(xiàn)，使DED的治療有了質(zhì)的進步。

1 血紅素衍生物

使用不同血液制品，在DED以及其他難治性重癥病例的治療中取得了顯著進展[8]。目前，最常見的制劑是使用自體或同種異體血清滴劑、血小板衍生的血漿產(chǎn)品和臍帶血血清(autologous serum，AS)[9]。

1.1 自體ASAS的生物力學(xué)和生物化學(xué)特性與正常淚液相同，AS中包含許多抗菌因子，如：IgG、溶菌酶和補體，有抑制細菌的作用[10]。血液是血液凝固后收集的全血液體部分?？梢酝ㄟ^離心去除凝塊，并將所得上清液(AS)制備成滴劑[8]。1975年有研究者應(yīng)用自體AS治療眼部堿性損傷[11]，1984年，Tsubota等[12]首次將其成功應(yīng)用于DED患者。1999年，AS應(yīng)用于不同眼表疾病的輔助治療開始被廣泛接受[13]。自體AS中，存在包括生長因子在內(nèi)的正常淚液中的各種物質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor，TGF-β)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factors，PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)和胰島素樣生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子P物質(zhì)(substance P，SP)、細胞因子、抑菌因子(乳鐵蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白)、纖連蛋白、維生素A。其中維生素A在角膜上皮細胞的移行和黏附過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，加速了眼表上皮的再生與修復(fù)[14]。已知TGF-β具有劑量依賴性抗增殖特性，其平均水平通常比自然眼淚高5倍，所以通常將其稀釋20%使用，避免產(chǎn)生影響上皮損傷愈合的潛在危害。然而未稀釋的血清在各種眼部手術(shù)術(shù)后角膜上皮細胞遷移和上皮愈合中更有效，其原因可能是纖連蛋白濃度較高，縮短了愈合時間并降低了慢性上皮缺陷和并發(fā)癥的風(fēng)險[15]。自體AS的制備過程中白細胞的存在增加了促炎細胞因子：IL-6、IL-1 和TNF等水平，免疫球蛋白和補體對許多遭受免疫學(xué)改變的患者可能是有害的[16]。AS儲存必須在-20 ℃的冷凍箱中進行，使用前必須解凍，如果要儲存24 h至1周，則必須保存在4 ℃的冰箱中。AS滴眼液必須在生產(chǎn)后的3個月內(nèi)使用[17]。自體AS中通常不含有防腐劑，因此降低了防腐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生毒性的風(fēng)險[12]。使用體積分數(shù)20%AS滴眼液可治療許多眼表疾病，尤其是DED，其中AS能抑制眼表上皮細胞凋亡并增加DED中的杯狀細胞密度[18]。AS滴眼液可以促進缺損的角膜上皮愈合、減輕眼部癥狀，減少因角膜屏障功能受損導(dǎo)致的并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險[19]。

1.2 異基因血清來自健康人的異基因血清(allogeneic serum，ALS)是在當(dāng)患者AS不適合、無法使用或無法進行重復(fù)采血的情況下使用的，包括病毒感染、敗血癥、嚴重貧血患者和多系統(tǒng)疾病的老年患者[20]。

ALS的應(yīng)用促進了一些具有大量炎癥和系統(tǒng)性成分的免疫介導(dǎo)疾病，這時應(yīng)避免將含有高濃度促炎細胞因子的ALS直接轉(zhuǎn)移至眼睛[20]。另一方面，ALS可以產(chǎn)生大量的眼淚促進治療后的眼部修復(fù)，使細胞因子、抗感染因子的組成標(biāo)準(zhǔn)化和篩選成為可能[20]。

1.3 富血小板血漿富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)包括來自患者自身血液的各種成分，可以通過離心獲得血小板濃度高于循環(huán)血液中的血漿部分[21]。富血小板的α 顆粒含有凝血因子和生長因子，被激活后血小板聚集，并最終由顆粒釋放各種生長因子，如PDGF、EGF和TGF-β，從而激發(fā)炎癥和傷口愈合的級聯(lián)反應(yīng)，然后參與傷口愈合和止血。已證實這些生長因子對細胞的生長、分化及免疫功能皆有重要的調(diào)節(jié)作用[22]。Dohan Ehrenfest等[23]將PRP成品按所含成分的不同分為純PRP(pure platelet-rich plasma，P-PRP)、富白細胞和血小板血漿(leukocyte-rich and platelet-rich plasm，L-PRP)、純富血小板纖維蛋白(pure platelet-rich fibrin，P-PRF)和富白細胞和血小板纖維蛋白(leukocyte-rich and platelet fibrin，L-PRF)4種主要類型。

白細胞對PRP的質(zhì)量影響很大。白細胞增加分解信號分子，例如與白細胞濃度密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9，MMP-9)。白細胞與PDGF和分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平呈正相關(guān)，與成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)水平呈負相關(guān)。全血中非血小板成分的作用有助于富血小板血漿的生物活性，特別是紅細胞和白細胞參與不必要的炎癥反應(yīng)可能是有害的。盡管白細胞會產(chǎn)生負面的促炎作用[24]，但其他研究表明，非血小板的細胞成分對于理想的血小板功能是很重要的，包括生成凝血酶形成強大的凝血能力，釋放生長因子，并由此產(chǎn)生的血清刺激細胞增殖能力等[25]。關(guān)于富含生長因子的血漿滴眼液的應(yīng)用，對常規(guī)治療無效果的嚴重DED患者的護理取得了很好的效果[26]，在中性粒細胞性疾病治療中特別成功[27]。最后，富含生長因子的血漿可用于支持角膜緣干細胞的生長。不同的研究評估了不同富血小板血漿制劑對淚膜質(zhì)量和癥狀嚴重程度均有所改善，即使以前用自體血清治療的患者也是如此[24]。富血小板血漿的使用有一定的禁忌證，如拔牙期、嚴重心臟病、活動性細菌感染，以及某些病毒性傳染病(乙型病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等)病史。

1.4 臍帶血血清像末梢血清一樣，臍帶血血清(umbilical cord blood serum，UCS)含有高濃度的淚液成分。與AS相比，EGF和TGF-β水平分別高3倍和2倍。UCS具有較高的NGF和SP水平和較低的IGF-1和維生素A水平，但均高于正常淚液中的水平[16]。UCS由于含有抗菌劑如免疫球蛋白G、溶菌酶和補體，顯示出抑菌效果[26]。與AS滴眼液相比，UCS滴眼液更有效地減輕DED癥狀并具有上皮營養(yǎng)作用，可以增加嚴重DED患者的杯狀細胞密度[16]。在分娩時可以從臍靜脈中抽取大量樣本，從而可以同時滿足幾個患者的需求。但必須評估過敏風(fēng)險和傳播腸外疾病的可能性[28]。

UCS滴眼液建議使用體積分數(shù)為20%，通常每天滴4～6次。在20 ℃下可儲存3～6個月[16]。其已被用于治療各種眼表疾病，包括有或沒有肖格倫綜合征的嚴重干眼、移植物抗宿主病中的眼部并發(fā)癥、持續(xù)性上皮缺陷、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病、角膜糜爛的復(fù)發(fā)以及眼部化學(xué)灼傷和角膜屈光手術(shù)的表面問題等[29]。

2 干細胞治療

2.1 間充質(zhì)干細胞間充質(zhì)干細胞(multipotent stromal cells，MSCs)(自動/同種異體)起源于中胚層，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞能夠分化成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細胞，還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用[30]。由于MSCs缺乏主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)表達和共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)，從而可以逃避T細胞和天然殺傷(natural killer，NK)細胞的識別和作用，所以其可以以同種異體方式使用[31]。未分化細胞的儲庫已經(jīng)在不同的成人或胚外組織中分離，用于其所在組織的再生[32]。其向細胞因子、趨化因子和生長因子釋放的病灶部位呈現(xiàn)遷移和歸巢能力[33]。已經(jīng)在眼中鑒定出不同的MSCs樣細胞群：基底角膜緣、角膜基質(zhì)、小梁網(wǎng)、脈絡(luò)膜和眶周脂肪[34]。不同的細胞類型存在于角膜表面，如上皮細胞、基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞，在免疫調(diào)節(jié)中起基本作用[35]。

MSCs對適應(yīng)性免疫和固有免疫均有較強的免疫抑制作用，如直接的細胞間接觸和分泌不同可溶性物質(zhì)等，主要包括TGF-β、肝細胞生長因子、前列腺素E2、IL-10、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indolamine2，3-dioxygenase，IDO)、一氧化氮、血紅素氧合酶1等[30]。研究表明，MSCs分泌的外基質(zhì)除了直接作用于常駐靶點之外，還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[36]。MSCs對適應(yīng)性免疫的抑制作用主要表現(xiàn)在對T淋巴細胞和B淋巴細胞的免疫抑制作用，對固有免疫的抑制作用主要表現(xiàn)在對單核細胞/巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞的免疫抑制作用[30]。MSCs的主要免疫調(diào)節(jié)機制之一是通過細胞與細胞接觸和其分泌物的抑制分子調(diào)節(jié)T細胞(CD4+和CD8+)[36]。調(diào)節(jié)性T細胞是外周免疫耐受的細胞介質(zhì)，并且其缺失會導(dǎo)致過度的多系統(tǒng)自身免疫[37]。另一方面是使用同種異體細胞來治療疾病。嚴重的DED角膜表面是有損傷的[4]。角膜上皮細胞層和更深的基質(zhì)層的損傷會涉及到在角膜緣區(qū)域中的祖細胞——角膜緣上皮干細胞(limbal epithelial stem cells，LESCs)活化介導(dǎo)的愈合過程[37]。LESCs的大量損失會導(dǎo)致持續(xù)的角膜上皮缺損和角膜結(jié)膜化[38]。MSCs表現(xiàn)出角膜上皮前體細胞的形態(tài)特征，檢測出角膜上皮前體細胞的標(biāo)志，包括Integrin D1、Cx43、Pax6和P63等，這說明在適宜條件下，MSCs能夠誘導(dǎo)分化為角膜上皮前體樣細胞，角膜緣生態(tài)位在除了存在角膜分化的角膜緣上皮干細胞/祖細胞群之外，還有一群MSCs位于其下面在角膜表面再生中起重要作用[39]。MSC治療在實驗性DED模型中改善了淚液量和淚膜穩(wěn)定性，增加了上皮恢復(fù)和杯狀細胞數(shù)目。

目前LESCs移植是歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)唯一授權(quán)的用于修復(fù)角膜表面病變的細胞療法。移植的MSCs通過產(chǎn)生營養(yǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)作用增強了角膜傷口的愈合，而不是直接轉(zhuǎn)化為角膜細胞[38]。形成角膜瘢痕是角膜傷口愈合的主要并發(fā)癥。MSCs的抗瘢痕能力已被廣泛報道[38]：角膜成纖維細胞(激活的基質(zhì)角膜細胞)的遷移及其反應(yīng)受到多種細胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)，這些細胞因子和生長因子是調(diào)節(jié)角膜成纖維細胞遷移的重要因素。已顯示MSCs是血管生成的良好激活劑，并分泌VEGF[35]。然而，MSCs似乎對角膜血管生成具有相反的作用，上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1；一種強大的抗血管生成因子)的表達，并顯著下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(一種炎癥相關(guān)的促血管生成因子)[40]。總之，基于抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗血管生成、眼淚生成和角膜傷口愈合等多種作用(減少嗜中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，幫助上皮恢復(fù)，減少結(jié)膜瞼板腺損傷數(shù)量以及增加杯狀細胞)，MSCs成為了治療DED的希望[40]。

2.2 MSCs分泌體MSCs分泌體通過自分泌或旁分泌的方式，改善機體局部微環(huán)境，促進內(nèi)源性干細胞向傷口部位的遷移和分化，挽救瀕臨凋亡的細胞，從而達到修復(fù)組織的目的。MSCs分泌因子在功能上主要可分為免疫調(diào)節(jié)、抗細胞凋亡、血管發(fā)生、支持干/祖細胞的增殖與分化、化學(xué)趨化、抗瘢痕6大類[41]。如上所述，MSCs的許多作用機制是通過釋放包含在分泌蛋白體概念下的各種生物活性物質(zhì)來實現(xiàn)的[42]。分泌體由可溶性因子和胞外囊泡組成，如微泡或外泌體[33]。其被認為是由約10%的人類基因組編碼[43]。分泌體在增殖、分化、通訊和遷移等細胞間相互作用和周圍組織中發(fā)揮關(guān)鍵作用[44]。

在眼部淺表疾病中使用分泌體的優(yōu)勢是可以防止傳統(tǒng)干細胞使用引起的一些不良反應(yīng)，包括對可能致癌的擔(dān)憂、缺乏允許異基因使用的免疫原性反應(yīng)以及感染的傳播[44]。干細胞被看作藥物倉庫，可用于組合藥物的制造、遞送，并且可針對不同的臨床應(yīng)用進行調(diào)整[43]。

3 結(jié)論

盡管DED有許多治療方法，但近年來新的再生治療已經(jīng)鞏固了對這種復(fù)雜疾病治療的新觀點。因此有必要對DED的治療方法進行標(biāo)準(zhǔn)化和比較，這是治療該疾病的重要希望，也是進一步發(fā)展藥理學(xué)和細胞療法干預(yù)的機會。