tRNA來源的小分子片段RNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展

崔洋洋，謝 暉，付子毅綜述，王 水審校

0 引 言

非編碼Small RNAs來自于基因組的各種未注釋和已注釋區(qū)域，主要包括microRNAs、siRNAs、piRNAs和tRNA來源的小分子片段RNA（transfer RNA-related fragments，tRFs）等，是生命活動的調(diào)控因子。由于其能夠介導(dǎo)基因沉默而被視作調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，近年來也逐步成為研究熱點［1-2］。隨著在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的第一個小分子RNA：line4，后續(xù)在生物體中發(fā)現(xiàn)了大量小分子RNA的存在［3-5］。過去，將長度約50～200 nts的非編碼RNA均稱為Small RNAs。但在近15年里，逐漸將其定義為長度約19～32nts的更小的 RNA分子［6］。大多數(shù)的Small RNAs是由編碼基因在RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄作用下產(chǎn)生的，如miRNAs和piRNAs。但仍有部分Small RNAs是由其他的一些非編碼的RNAs，如Y RNAs和tRNAs在RNA聚合酶Ⅲ（RNA PolⅢ）作用下切割形成［7-8］。Small RNAs近年來之所以成為研究熱點是因其能夠通過RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制來調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)［2］。此外，Small RNAs可參與真核生物的多種生命進程，包括隔代遺傳和表觀記憶等［9］。目前研究最成熟的一類Small RNAs當(dāng)屬miRNAs，miRNAs可通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯，從而發(fā)揮基因調(diào)控功能。然而，在通過對全基因組的miRNAs表達(dá)測序以及生物學(xué)分析的過程中，又發(fā)現(xiàn)了一些新的小分子RNA，能夠與mRNAs，rRNAs或tRNAs的序列相匹配。在這些新一類的Small RNAs中，目前研究較多的為tRFs。tRFs是指tRNA來源的小分子片段RNA，是在特定的細(xì)胞或組織中，或細(xì)胞在應(yīng)激等特定條件下，由特定的核酸酶在tRNA的環(huán)上剪切，產(chǎn)生的特定大小的小片段RNA。目前研究發(fā)現(xiàn)，tRFs在細(xì)胞增殖、病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的啟動、RNA加工、DNA損傷反應(yīng)調(diào)控、腫瘤抑制和神經(jīng)元退化等方面發(fā)揮著重要作用。本文將從tRFs的來源及其分類、生物學(xué)功能及其在腫瘤中的研究進展作一綜述。

1 tRFS的來源及其分類

在生物體內(nèi)，DNA分子上的tRNA基因在RNA PolⅢ）的作用下轉(zhuǎn)錄生成tRNA前體，在tRNA前體分子的5′端和3′端分別有附加的核苷酸序列，被稱為前導(dǎo)序列和尾隨序列［10-11］。tRNA前體加工成熟的tRNA過程主要包括：①核糖核酸酶P（RNase P）切除前體分子中的前導(dǎo)序列，核糖核酸酶Z（RNase Z）通過內(nèi)切核苷酸的裂解作用切除尾隨序列；②形成tRNA成熟分子所具有的修飾核苷酸；③在tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下在前體分子3′端加上“CCA”序列［12］。

通過高通量測序以及對Small RNAs片段分析，發(fā)現(xiàn)了一類能夠與已知tRNA基因相匹配的非編碼小分子 RNA，稱之為 tRFs［13-17］。根據(jù)其與初始 tRNA或者成熟的tRNA所匹配的不同區(qū)域，又進一步將其分為不同的亞型，因此形成了一個關(guān)于tRFs的數(shù)據(jù)庫，每個特定的tRF均有其對應(yīng)的編碼［18］。

1.1 tiRNAs最早被發(fā)現(xiàn)的一類tRFs被稱為tiRNAs（tiR），長度約30～40nts，是在多種應(yīng)激條件下于成熟的tRNA分子反密碼環(huán)處發(fā)生特定切割產(chǎn)生的5′-和3′-tRNA半分子。盡管其被認(rèn)為是在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的RNA片段，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在無應(yīng)激條件仍可產(chǎn)生［19］。tiR具有兩個亞型，即5tiR和3tiR。5tiR起始于成熟tRNA的5′端并終止于反密碼環(huán)，而3tiR則起始于反密碼環(huán)并終止于3′端［20-21］。tiR是在核糖核酸酶（A或T）以及血管生成素（Ang）的作用下產(chǎn)生，因此tiR具有5′-OH而非5′-磷酸基，這與miRNA和siRNA分別在Dicer和RNaseⅢ作用下的形成機制有所不同［15，22-23］。

1.2 tRFs另一類來源于tRNA的Small RNAs與成熟tRNA或初始tRNA的末端相匹配，長度約14～30nts。由于這一類tRFs長度同miRNAs相似，并具有5′-磷酸基和3′-OH，近年來逐漸得到關(guān)注［15］。根據(jù)其所匹配的tRNA區(qū)域不同，可將其分為三類，即：tRF-5、tRF-3和tRF-1［13］。tRF-5、tRF-3分別來源于成熟tRNA的5′和3′端，而tRF-1來源于初始tRNA的3′端。tRF-5長度約1～30nts，是在tRNA的D環(huán)或D環(huán)與反密碼環(huán)之間的莖區(qū)域切割形成。根據(jù)其長度，又將其分為三個亞型：tRF-5a（14-16nts）、tRF-5b（22-24nts）和 tRF-5c（28-30nts）［24］。tRF-3 主要分為tRF-3a（18nts）和tRF-3b（22nts）兩個亞型，這兩個亞型的tRF-3切割點均在TΨC環(huán)［24］。目前上述tRFs亞型均可在目前的Small RNA數(shù)據(jù)庫中查詢到，然而根據(jù)高通量測序數(shù)據(jù)顯示，仍存在一些其他的tRNA來源的小分子RNA片段未被涉及［18］。

部分學(xué)者認(rèn)為，類似于pre-miRNAs，一些tRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也可經(jīng)過Drosha和Dicer蛋白復(fù)合體的加工發(fā)生交叉折疊［14，25-27］。然而通過對野生型和Dicer/Drosha敲除細(xì)胞的Small RNAs測序結(jié)果對比分析顯示，兩者之間的tRFs含量和種類并無顯著差異［16，24，26］。因此，可推斷 tRFs并非 Dicer和 Drosha或DGCR8（Drosha復(fù)合體的重要主成部分）作用的產(chǎn)物，但具體是何種酶的作用尚未得到證實。tRF-1來源于初始RNA的尾隨序列，通過對其分析可發(fā)現(xiàn)，tRF-1的5′端同RNaseZ的切割位點相匹配，3′端同RNA PolⅢ的轉(zhuǎn)錄終止信號相匹配。因此，可推斷這類tRFs是在tRNA前體成熟的過程中由核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的。

除以上提到的tiRs和tRFs，還有一類tRNA來源的小RNA片段tRF-2s，這類tRFs僅包含tRNA的反密碼環(huán)和莖［28-29］。在與CLP1突變相關(guān)的一種罕見的神經(jīng)退行性疾病患者中，有文獻(xiàn)報道了一種相對少見的tRFs。研究發(fā)現(xiàn)，由于CLP1可參與tRNA的剪切活動，在這些患者的神經(jīng)元細(xì)胞中，可出現(xiàn)內(nèi)含子或類似于3tiR的3′外顯子的聚集［29-30］。同時，當(dāng)將這些類似于3-tiR的片段轉(zhuǎn)染入神經(jīng)元細(xì)胞中，會導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。因此，可推斷這類RNA片段在神經(jīng)元細(xì)胞中的聚集有可能是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的原因之一。

2 tRFs的生物學(xué)功能

tRFs作為新一類的Small RNAs，研究報道其可在多種生物體中表達(dá)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，tRFs可在基因表達(dá)調(diào)控，表觀遺傳，神經(jīng)元退化，腫瘤抑制等方面發(fā)揮著多種生物學(xué)功能。

2.1 tRFs可參與多種基因表達(dá)調(diào)控根據(jù)PARCLIP數(shù)據(jù)分析顯示，tRF-3s與P-boby的形成相關(guān)［31］。P-body胞漿復(fù)合體是mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程的一個重要場所，在基因表達(dá)過程中起到了至關(guān)重要的作用，參與mRNA降解、翻譯抑制、mRNA監(jiān)視以及RNA介導(dǎo)基因沉默等。眾所周知，miRNAs可直接作用于P-body，隨后導(dǎo)致目標(biāo)RNA的降解。然而，tRF-3s是否能夠發(fā)揮相似的功能有待進一步論證。

據(jù)文獻(xiàn)報道，tRF-3006可與宿主細(xì)胞tRNA-Lys的56～67位核苷酸相結(jié)合，即與HIV基因組RNA的引物結(jié)合位點相結(jié)合，從而作為引物在逆轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用［32］。同時，tRF-3006還可與Ago2相結(jié)合，從而發(fā)揮沉默報告基因的作用。

2.2 tRFs可改變基因的表觀遺傳狀態(tài)最新兩項研究表明，5tiR在表觀遺傳中發(fā)揮著重要的作用［33-34］。在對低蛋白飲食小鼠分離出的精子中可檢測到某些特定的tRFs表達(dá)上調(diào)，如tRF-Gly-CCC/-TCC/-GCC，tRF-Lys-CTT和tRF-His-GTG等。tRF-Gly-CCC可抑制近70個與內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子MERVL相關(guān)的基因表達(dá)，故說明tRFs可調(diào)節(jié)基因組特定區(qū)域的基因表達(dá)［33］。在另一項研究發(fā)現(xiàn)，高脂肪飲食小鼠的精子可產(chǎn)生糖耐量受損的后代，同時也進一步檢測發(fā)現(xiàn)存在一些5tiR的表達(dá)異常。將這些異常表達(dá)的5tiR直接轉(zhuǎn)入到早期胚胎中，研究發(fā)現(xiàn)這部分5tiR可與多種基因的啟動子區(qū)域發(fā)生相互作用從而導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)［34］。綜上，5tiR可通過改變基因的表觀遺傳狀態(tài)以及與基因的啟動子區(qū)域發(fā)生相互作用來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。

2.3 tRFs與神經(jīng)元退化具有一定相關(guān)性神經(jīng)元退化相關(guān)的tRFs是一類來源于tRNA前體并具有神經(jīng)相關(guān)性的tRNA片段，目前證實其與神經(jīng)元的丟失相關(guān)［35］。CLP1是一種作用于tRNA前體的內(nèi)含子剪切酶，研究發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)退行性疾病患者體內(nèi)可發(fā)生突變，因突變的CLP1不能與tRNA內(nèi)切酶復(fù)合物（tRNA endonuclease complex，TSEN）相互作用，從而影響了含有內(nèi)含子的tRNA的剪切［36］。其具體機制為：TSEN可在tRNA的3′端內(nèi)含子與外顯子的交界處介導(dǎo)tRNA的剪切，但當(dāng)CLP1發(fā)生突變，3′端外顯子的5′-OH不能被磷酸化，從而阻滯后續(xù)剪切活動的發(fā)生，進一步導(dǎo)致tRNA的內(nèi)含子亦或是來源于3′端外顯子的3tiR樣的RNA片段在患者體內(nèi)細(xì)胞中積聚。但患者體內(nèi)并不缺乏相應(yīng)的成熟tRNA。因此，盡管將3tiR樣的RNA片段轉(zhuǎn)染到神經(jīng)元中會導(dǎo)致細(xì)胞毒性的增加，但是tRNA的內(nèi)含子和來源于3′端外顯子的3tiR樣的RNA片段在患者體內(nèi)細(xì)胞中積聚，還是神經(jīng)元中特定tRNA的缺失導(dǎo)致此類疾病的發(fā)生發(fā)展有待進一步實驗論證。

3 tRFs在惡性腫瘤中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中許多tRFs均有表達(dá)差異，如在女性乳腺癌細(xì)胞中，來源于 tRNA-Arg、tRNA-Asn、tRNA-Lys、tRNA-Gln、tRNA-Gly、tRNA-Leu、tRNA-Ser、tRNA-Trp以及同工受體tRNA-Val的tRFs可出現(xiàn)不同程度的表達(dá)上調(diào)［37］。同時在對前列腺癌tRFs轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析，Olvedy等［38］建立了一個針對前列腺癌不同分期的tRFs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有110多種tRFs出現(xiàn)不同程度的異常表達(dá)。但目前對于引起tRFs在腫瘤中表達(dá)水平發(fā)生改變的具體原因還未得到證實。

作為調(diào)節(jié)性RNA，tRFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色，已經(jīng)引起生命科學(xué)界的濃厚興趣。眾所周知，缺氧是大多數(shù)實體腫瘤的特征之一，同時也是腫瘤細(xì)胞遇到的最主要的刺激因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，部分tRFs可在缺氧等應(yīng)激條件下產(chǎn)生，從而進一步發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞功能的作用［28］。這一理論與腫瘤細(xì)胞由于自身對轉(zhuǎn)錄控制的缺陷，而試圖通過RNA沉默來阻止對基因組控制缺失相輔相成［2］。反之亦然，應(yīng)激條件下，tRFs可促進SGs的組裝，從而誘導(dǎo)翻譯抑制。

3.1 tRFs可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖能力

3.1.1 tRFs通過競爭結(jié)合YBX-1位點抑制腫瘤細(xì)胞的增殖據(jù)文獻(xiàn)報道，在乳腺癌細(xì)胞中，tRFs與RNA結(jié)合蛋白YBX-1相關(guān)。YBX-1蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞耐藥性、腫瘤的治療及預(yù)后中發(fā)揮著極為重要的作用，并證實其可在多種腫瘤中異常表達(dá)［28］。最新研究報道，在YBX-1蛋白復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性的tRFs（i-tRFs），其可與AKT、EIF4G1或HMGA1等致癌轉(zhuǎn)錄物競爭結(jié)合YBX-1［28］。同時，一些特定的 i-tRFs，如 tRF-Asp、tRF-Glu、tRF-Gly在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，相反，這些tRFs過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。反之，若將YBX-1敲除，則不能出現(xiàn)上述現(xiàn)象。由此可見，YBX-1可調(diào)控tRFs介導(dǎo)的抑癌反應(yīng)，tRFs的表達(dá)也預(yù)示著機體對致癌性刺激產(chǎn)生的抑制反應(yīng)。然而，隨著乳腺癌的病情惡化，則會出現(xiàn)tRFs的下調(diào)或YBX-1的上調(diào)，說明上述抑癌機制也可被遏制。這正是在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中會出現(xiàn)以上特定tRFs的低表達(dá)的原因［28］。

3.1.2 tRFs參與細(xì)胞周期進程調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖tRF-1001是由ELAC2/RNaseZ在pre-tRNASer-TGA的3′端發(fā)生切割形成［13］。研究表明，在前列腺癌細(xì)胞系中，tRF-1001表達(dá)量與細(xì)胞增殖成正相關(guān)，同時tRF-1001過表達(dá)可促進前列腺癌細(xì)胞從G2期向M期轉(zhuǎn)變。根據(jù)PAR-CLIP和CLASH數(shù)據(jù)分析顯示，包括tRF-1001在內(nèi)的tRF-1s均與Ago蛋白之間無相關(guān)性，提示tRF-1001促進腫瘤細(xì)胞從G2期向M期轉(zhuǎn)變的作用機制與miRNAs發(fā)揮的基因調(diào)控機制大相徑庭。

然而，Hauseecker等［30］研究發(fā)現(xiàn)，tRF-1001 與Ago蛋白存在一定的相關(guān)性，尤其是Ago-3和Ago-4。tRF-1001過表達(dá)之所以不能夠抑制含有其互補序列報告基因的表達(dá)，是由于缺乏對Ago-3和Ago-4的剪切機制。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)入tRF-1001的反義寡核苷酸卻可沉默其報告基因，這是由于含有tRF-1001序列的分子可雙相通過Ago2復(fù)合體，隨后產(chǎn)生si-RNA樣的基因抑制作用。

3.1.3 tRFS可通過抑制內(nèi)源性RPA1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖tRF-3027是一類來源于tRNAGly-GCC的RNA片段，長度約22nts。Maute等［27］研究發(fā)現(xiàn)，tRF-3027在胚胎、生發(fā)中心以及人源性記憶性B細(xì)胞中高表達(dá)，且與Ago1-4密切相關(guān)。然而，在轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞亦或是淋巴瘤活檢組織中，tRF-3027并不高表達(dá)，提示tRF-3027可能具有抑制B細(xì)胞惡化的作用。此外，過表達(dá)tRF-3027或其親本tRNA（tRNA-Gly-GCC）均可抑制其目的RNA（單鏈DNA結(jié)合蛋白RPA1的mRNA）的表達(dá)。RPA1在DNA的復(fù)制和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［27］。故tRF-3027抑制內(nèi)源性RPA1的表達(dá)，進而可抑制細(xì)胞增殖及調(diào)控DNA的修復(fù)。

3.1.4 tRFs可通過調(diào)控AURKA促進腫瘤細(xì)胞的增殖Yao等［39］發(fā)現(xiàn)一類來源于tRF-Leu-CAG的RNA片段在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)增高，并與腫瘤的分期具有一定相關(guān)性，且可通過調(diào)控AURKA來增強肺癌細(xì)胞的增殖能力。AURKA是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過與中心體結(jié)合來調(diào)控有絲分裂。研究發(fā)現(xiàn)，AURKA在多種腫瘤中表達(dá)異常，且可參與多條重要的細(xì)胞信號通路，作為激酶直接或間接激活多種致癌蛋白，或使多種抑癌蛋白失活，從而推動腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3.2 tRFs與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)Telonis等［40］研究發(fā)現(xiàn)，tRFs與調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)的MAPK和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)。在對MAPK通路的研究中發(fā)現(xiàn)，tRFs的表達(dá)同MAPK14以及RKIP相關(guān)［40］。RKIP是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族成員，目前研究發(fā)現(xiàn)其可作為前列腺癌的轉(zhuǎn)移標(biāo)志，其異常表達(dá)可能影響腫瘤轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生、抗凋亡能力以及染色體的完整性。在對Wnt/β-catenin信號通路的研究中發(fā)現(xiàn)，tRFs的表達(dá)同該通路中的許多重要成分相關(guān)，包括細(xì)胞表面的Frizzled蛋白受體，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及相關(guān)的基因調(diào)控分子［40］。但具體作用機制尚未得到證實。

4 結(jié) 語

tRFs作為新一類的非編碼Small RNAs，根據(jù)其所匹配的親本tRNA轉(zhuǎn)錄物的特定區(qū)域?qū)⑵溥M行分類，但不可否認(rèn)這些不同分類的tRFs存在功能上的交叉。同時，一些低表達(dá)的未能編入tRFs數(shù)據(jù)庫的tRFs或許也具有重要的生物學(xué)功能，有待進一步的研究發(fā)現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)tRFs可在細(xì)胞增殖、基因表達(dá)調(diào)控、RNA加工、腫瘤抑制和神經(jīng)元退化等方面發(fā)揮著重要的作用，但是這些tRFs是否與其親本tRNA存在一些功能上的交叉，亦或是存在一定的關(guān)聯(lián)有待進一步的實驗論證。

在腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性tRFs對腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著一定的作用，隨著研究的深入，必將對腫瘤的臨床治療與預(yù)后提供分子水平的參考依據(jù)。