自噬在肺纖維化中的作用機(jī)制

歐文芳，劉 剛，王亞紅，宋澤慶

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院a.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，b.呼吸內(nèi)科，廣東 湛江 524001)

肺纖維化是一種慢性、漸進(jìn)性的肺間質(zhì)性疾病，由持續(xù)的肺泡上皮細(xì)胞損傷和病理性損傷修復(fù)所致，可通過(guò)影響肺換氣導(dǎo)致嚴(yán)重的肺功能障礙，從而引起致命性的后果。臨床上，肺纖維化多表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難伴有刺激性干咳，病情呈進(jìn)行性發(fā)展，患者最終因呼吸衰竭而死亡。肺纖維化患者的中位生存時(shí)間一般為3年[1]。肺移植曾是提高其患者生存率的唯一方法，近年美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)了兩種藥物用于治療特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)，分別為尼達(dá)尼布和吡非尼酮，但其確切作用機(jī)制尚未完全明確[1]。雖然已有病理學(xué)研究證實(shí)了部分參與發(fā)病進(jìn)程的相關(guān)機(jī)制，但I(xiàn)PF的發(fā)病機(jī)制仍不清晰。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)自噬功能障礙在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其通過(guò)參與成纖維細(xì)胞活化、肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積等途徑促進(jìn)肺纖維化，提示自噬可能是肺纖維化發(fā)病的重要機(jī)制之一[2]，而靶向調(diào)控自噬有望為肺纖維化的診療提供新靶點(diǎn)。現(xiàn)就自噬在肺纖維化中的研究進(jìn)展予以綜述，旨在闡明自噬在肺纖維化中的作用機(jī)制。

1 自 噬

自噬是細(xì)胞自身降解陳舊蛋白、細(xì)胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以實(shí)現(xiàn)自身代謝需要和特定細(xì)胞器更新的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，其信號(hào)調(diào)控主要通過(guò)依賴哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和不依賴mTOR途徑。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/mTOR信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、運(yùn)動(dòng)和存活的核心途徑[3]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在饑餓、缺氧、氧化應(yīng)激、病原體感染、輻射和藥物等應(yīng)激情況下，自噬水平升高[4]。

自噬主要分為微自噬、巨自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬3種類型，雖然三者在形態(tài)學(xué)上互不相同，但最終均是將內(nèi)容物運(yùn)送到溶酶體中進(jìn)行降解和再循環(huán)，其中巨自噬的研究最為廣泛。在生理?xiàng)l件下，巨自噬以低水平發(fā)生，其通過(guò)降解受損或多余的細(xì)胞器以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。在應(yīng)激條件下，自噬被誘導(dǎo)活化并通過(guò)降解胞內(nèi)代謝物促進(jìn)物質(zhì)合成或能量產(chǎn)生，從而保證細(xì)胞存活[4]。雖然巨自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，但過(guò)度的自我降解是有害的。因此，自噬功能障礙與多種人類疾病有關(guān)，包括肺纖維化、神經(jīng)變性、癌癥、衰老等。

巨自噬又分為非特異性巨自噬和選擇性巨自噬。在營(yíng)養(yǎng)或能量匱乏的情況下，非特異性巨自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活，而選擇性巨自噬具有高度特異性，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用。線粒體自噬是一種對(duì)線粒體進(jìn)行降解的選擇性巨自噬，對(duì)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)更新和特定細(xì)胞的發(fā)育、自我清除起重要作用[3]。其是一種針對(duì)線粒體更新，調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量與細(xì)胞能量需求匹配，并清除受損和功能失調(diào)的線粒體的選擇性和適應(yīng)性反應(yīng)。如在哺乳動(dòng)物中，紅細(xì)胞的成熟是通過(guò)線粒體自噬清除未成熟紅細(xì)胞中的線粒體而實(shí)現(xiàn)[3]。目前，線粒體自噬主要有以下兩種途徑：①紅細(xì)胞的成熟是通過(guò)BNIP3L(Bcl-2/E1B 19 kDa-interacting protein 3-like)-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubules associated protein 1 light chain 3，LC3)相互作用識(shí)別自身線粒體而達(dá)到清除線粒體的目的；②在清除受損線粒體時(shí)，PARK(Parkin)2通過(guò)與線粒體膜上的PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)結(jié)合，對(duì)線粒體外膜蛋白進(jìn)行泛素化，使其與LC3相互作用的受體SQSTM1(sequestosome-1)/p62結(jié)合而達(dá)到清除線粒體的目的。雖然兩種途徑最終均與LC3相互作用導(dǎo)致線粒體降解[3]，但目前關(guān)于線粒體自噬的機(jī)制仍未完全清晰。無(wú)論是從代謝、活性氧類產(chǎn)生，還是線粒體DNA損傷累積方面，線粒體損傷均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[5]。因此，線粒體自噬是維持細(xì)胞完整性和正常生理功能的重要過(guò)程。

2 自噬在肺纖維化中的作用

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IPF患者的肺組織表現(xiàn)為p62和自噬體數(shù)目增加[2,6]，而在成纖維細(xì)胞灶內(nèi)mTOR活性較高，LC3B的表達(dá)減少[7]，說(shuō)明自噬參與了肺纖維化的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，用促纖維化因子白細(xì)胞介素-17處理肺上皮細(xì)胞可減少自噬相關(guān)重要基因的表達(dá)，包括Beclin1、自噬相關(guān)基因(autophagy related genes,Atg)14[8]。因此，自噬功能障礙被認(rèn)為在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了作用。

2.1調(diào)控ECM的沉積 肌成纖維細(xì)胞過(guò)度表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白并促進(jìn)ECM沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化。在IPF患者肺分離的成纖維細(xì)胞中，LC3B水平降低，磷酸化Akt和磷酸化mTOR增加[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在肺成纖維細(xì)胞中，通過(guò)敲除LC3B和Atg5基因抑制自噬可以誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化，并使α平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加，其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)的纖維化效果一致[2]，說(shuō)明抑制自噬的活化可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)ECM沉積。Atg4b缺陷小鼠在博來(lái)霉素處理后炎癥反應(yīng)加劇，并導(dǎo)致肺組織廣泛纖維化和膠原沉積[9]，提示自噬不足可誘導(dǎo)膠原沉積。Nho和Hergert[7]發(fā)現(xiàn)，肺纖維化中病理性肌成纖維細(xì)胞表型ECM的分泌能力更強(qiáng)。當(dāng)正常成纖維細(xì)胞受到大量的膠原聚合刺激時(shí)，自噬被激活；然而，IPF患者肺中的肌成纖維細(xì)胞沒(méi)有這種應(yīng)激反應(yīng)[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在IPF患者肺成纖維細(xì)胞中叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)O3a信使RNA和蛋白水平明顯降低，而FOXO3a是蛋白激酶B的下游靶標(biāo)且涉及自噬的轉(zhuǎn)錄激活，因此在膠原富集的過(guò)程中,FOXO3a的表達(dá)下調(diào)使LC3B信使RNA水平也明顯降低[10]，表明通過(guò)抑制FOXO3a來(lái)抑制自噬可促進(jìn)肺纖維化[11]。此外，雷帕霉素也可抑制肌成纖維細(xì)胞中α平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白的表達(dá)[6]。可見(jiàn)，自噬可調(diào)控肺纖維化ECM沉積進(jìn)程，但其在ECM沉積中的具體分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

2.2緩解肺上皮細(xì)胞功能障礙 上皮細(xì)胞是肺組織的重要屏障，既能分泌抗纖維化、抗炎介質(zhì)[12]，也能分泌促纖維化因子，在肺纖維化的形成中起關(guān)鍵作用[13-14]。有假說(shuō)認(rèn)為，上皮細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致慢性或持續(xù)性肺損傷，進(jìn)而促進(jìn)纖維化[15]。因此，有關(guān)自噬在上皮細(xì)胞中的表現(xiàn)與纖維化的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。在肺表面活性蛋白(SPC或SPA)基因突變或Hermansky-Pudlak綜合征相關(guān)肺間質(zhì)性疾病中，突變蛋白錯(cuò)誤折疊后在上皮細(xì)胞內(nèi)大量積累，可導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激和纖維化[16]。這種突變蛋白的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致自噬流阻滯，線粒體自噬減少，從而破壞胞內(nèi)蛋白平衡，且攜帶這種突變蛋白的患者處理繼發(fā)性肺損傷的能力會(huì)降低，故使得上皮細(xì)胞更容易受到損傷并發(fā)生纖維化。此外，在Hermansky-Pudlak綜合征患者的上皮細(xì)胞及Hermansky-Pudlak綜合征基因突變小鼠中也可以觀察到自噬功能障礙。另有報(bào)道，A549細(xì)胞中的Hermansky-Pudlak1基因敲除導(dǎo)致LC3B減少和p62累積，而過(guò)表達(dá)LC3B能恢復(fù)自噬功能并減少p62的累積[17]。條件性敲除小鼠上皮細(xì)胞中的結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物1基因，使得博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠更容易發(fā)生肺纖維化，而通過(guò)雷帕霉素活化自噬后，這種情況可以逆轉(zhuǎn)[18]。故認(rèn)為，自噬不足導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能障礙繼而促進(jìn)肺纖維化，而激活自噬可增強(qiáng)上皮細(xì)胞修復(fù)能力，延緩肺纖維化。但自噬是如何調(diào)控并影響上皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究探討。

2.3參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個(gè)上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換分化為間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，這在肺纖維化的形成過(guò)程中起重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中，Atg7功能喪失導(dǎo)致TGF-β上調(diào)并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這種情況較博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化更嚴(yán)重[15]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑抑制A549細(xì)胞的自噬，從而加速其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[19]。以上研究表明，抑制自噬活化能有效誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化，進(jìn)而加速上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。目前，大部分有關(guān)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究集中在腫瘤細(xì)胞，而相關(guān)研究表明肺纖維化的發(fā)生與腫瘤部分通路發(fā)生相似[20-23]，故有關(guān)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肺纖維化的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

2.4減少細(xì)胞凋亡 據(jù)報(bào)道，在IPF中成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞具有高度的抗凋亡活性[24]。在IPF患者的肺成纖維細(xì)胞中，Beclin1的表達(dá)下調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加[20]。自噬相關(guān)基因Atg4b缺陷小鼠在用博來(lái)霉素處理7 d后，其肺泡和支氣管上皮細(xì)胞凋亡增加[9]。同時(shí)在IPF患者肺成纖維細(xì)胞中也觀察到，當(dāng)mTOR通路持續(xù)激活時(shí)，其抗凋亡能力顯著增強(qiáng)[25]，而當(dāng)FOXO3a和LC3B的表達(dá)減少時(shí)，Ⅰ型膠原基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少[10]?；謴?fù)FOXO3a或LC3B的表達(dá)后，成纖維細(xì)胞對(duì)膠原基質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡恢復(fù)敏感[10]。Nho和Hergert[7]發(fā)現(xiàn)，異常激活的人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/Akt/mTOR信號(hào)通路可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞在膠原合成上發(fā)生自噬，從而使細(xì)胞存活。因此，自噬可通過(guò)mTOR通路減少成纖維細(xì)胞凋亡，從而增加其抗凋亡能力。目前，關(guān)于自噬如何參與凋亡的機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步探討。

2.5協(xié)同TGF-β1信號(hào)通路 TGF-β是肺纖維化的主要調(diào)節(jié)因子之一[26]，而許多自噬基因(Atg4c、Atg5、Atg7、Atg16l1、Atg16l2、氨基丁酸受體相關(guān)蛋白、PARK、PINK1、p62和泛素樣激酶2)與TGF-β的調(diào)控相關(guān)[27]。TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)ECM沉積，其被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[28]；同時(shí)，它可以抑制成纖維細(xì)胞中的自噬[27]。此外，TGF-β能誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞分化，并增加纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，激活mTOR通路，減少LC3B和增加p62的表達(dá)[6]。Tubastatin可通過(guò)抑制TGF-β誘導(dǎo)的PI3K-Akt-低氧誘導(dǎo)因子-1α-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑減少自噬發(fā)生，抑制膠原蛋白的沉積[29]。而敲減Beclin1或LC3使得TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化增強(qiáng)，纖連蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白蛋白表達(dá)水平上調(diào)更為明顯[6]。相反，雷帕霉素能減弱TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化[6]。干擾真核生物延伸因子2激酶表達(dá)后，mTOR信號(hào)通路被激活，TGF-β1對(duì)自噬的影響增強(qiáng)，LC3B蛋白減少，p62蛋白水平升高。而雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)TGF-β對(duì)真核生物延伸因子2激酶缺陷的成纖維細(xì)胞作用[30]。沉默LC3和Atg5基因增加了α平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，且TGF-β處理能進(jìn)一步升高它們的表達(dá)水平[2]。目前，關(guān)于TGF-β1介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路如何協(xié)同自噬參與肺纖維化發(fā)病的機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，需進(jìn)一步探討。

2.6介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS) ERS是肺纖維化發(fā)病的重要機(jī)制之一，能夠有效誘導(dǎo)自噬激活。其主要通過(guò)PERK-eIF2α-ATF4-CHOP級(jí)聯(lián)激活自噬基因轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)IRE1-c-Jun氨基端激酶介導(dǎo)Bcl-2的磷酸化，使Beclin1與Bcl-2解離，從而活化Vps34促進(jìn)自噬體形成[1,31]。Araya等[2]在人支氣管上皮細(xì)胞中使用Torin1(mTORC1/2抑制劑)或沉默LC3或Atg5基因可加劇ERS，從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Bueno等[32]用衣霉素(ERS誘導(dǎo)劑)誘導(dǎo)A549細(xì)胞ERS，導(dǎo)致線粒體去極化和細(xì)胞凋亡；當(dāng)使用巴弗洛霉素A1抑制自噬時(shí)加劇了線粒體去極化和細(xì)胞凋亡，說(shuō)明自噬不足會(huì)加劇ERS破壞線粒體的穩(wěn)態(tài)。在小鼠體內(nèi)，通過(guò)氣管內(nèi)注射衣霉素或感染鼠皰疹病毒68(與EB病毒同源)可引起體內(nèi)ERS和PINK1的表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)生肺纖維化；但敲除PINK1小鼠肺中的p62表達(dá)增加，纖維化加重[32]。Bueno等[33]還發(fā)現(xiàn)隨著年齡增加，持續(xù)的ERS會(huì)減少PINK1的表達(dá)，且在肺泡上皮細(xì)胞中ERS可誘導(dǎo)PINK1的轉(zhuǎn)錄抑制因子活化轉(zhuǎn)錄因子3的表達(dá)，從而抑制自噬。目前，關(guān)于ERS如何介導(dǎo)自噬調(diào)控肺纖維化的機(jī)制尚未完全清楚，需要進(jìn)一步研究。

2.7調(diào)節(jié)血管緊張素(angiotensin，Ang) 腎素-Ang系統(tǒng)在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[34-35]。腎素-Ang系統(tǒng)包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶/AngⅡ/AngⅡ-1型受體和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2/Ang-(1～7)/Max兩大軸系。AngⅡ通過(guò)其特異性受體AngⅡ-1型受體參與肺部多種疾病的發(fā)生發(fā)展，而Ang-(1～7)通過(guò)作用于其特異性受體Max發(fā)揮對(duì)AngⅡ的拮抗作用。AngⅡ在肺纖維化中是誘導(dǎo)膠原合成、自噬發(fā)生和膠原降解的關(guān)鍵因子。Meng等[36]發(fā)現(xiàn)，自噬通過(guò)氧化還原調(diào)節(jié)AngⅡ引起的活性氧增加和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體激活過(guò)程，從而減輕肺纖維化。而Ang-(1～7)可減弱活性氧引起自噬受損，改善與吸煙相關(guān)的肺纖維化[37]。此外，過(guò)表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2可以增強(qiáng)自噬，改善肺部膠原的沉積[38]。目前，關(guān)于Ang如何協(xié)調(diào)自噬參與IPF發(fā)生、發(fā)展的報(bào)道甚少，有待進(jìn)一步研究。

2.8指導(dǎo)肺纖維化的臨床用藥 在臨床用藥中，美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)了兩種用于治療IPF的藥物，分別是吡非尼酮和尼達(dá)尼布。已有報(bào)道，敲減Atg5和Atg7基因明顯抑制了吡非尼酮誘導(dǎo)的自噬，表明吡非尼酮可以激活經(jīng)典的自噬途徑[39]。PARK2介導(dǎo)的線粒體自噬在肺纖維化中起調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞分化的作用[40]，吡非尼酮可通過(guò)PARK2促進(jìn)LC3的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)自噬，從而調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞分化。但是，吡非尼酮的抗纖維化功能主要通過(guò)抗氧化作用實(shí)現(xiàn)，敲除PARK2基因可使血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)衰減，而吡非尼酮抗氧化活性并不完全依賴于PARK2介導(dǎo)的線粒體自噬，故證明吡非尼酮可部分通過(guò)自噬激活參與肺纖維化進(jìn)程[39]。而尼達(dá)尼布可以激活非經(jīng)典自噬途徑，下調(diào)IPF中成纖維細(xì)胞的ECM生成能力，減少纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，并抑制原代人成纖維細(xì)胞中TGF-β相關(guān)通路的激活[41]。因此，治療肺纖維化藥物的作用機(jī)制與自噬密切相關(guān)，它們通過(guò)促進(jìn)自噬改善肺纖維化。

3 小 結(jié)

目前，雖然有不少獲批上市的治療肺纖維化藥物，但其確切作用機(jī)制仍不完全清楚，因此亟須闡明新的IPF發(fā)病機(jī)制和尋找更有效的藥物靶點(diǎn)阻斷肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。自噬作為細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，不僅參與了氨基酸供應(yīng)，還參與了各種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和清除有害物質(zhì)起重要作用。隨著研究的不斷深入，目前大部分證據(jù)表明自噬缺陷廣泛存在于ECM富集、肺上皮細(xì)胞功能障礙、凋亡、TGF-β信號(hào)刺激、ERS、Ang系統(tǒng)等促進(jìn)肺纖維的發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)活動(dòng)中。因此，自噬有望為IPF的治療提供新靶點(diǎn)和方向。但自噬如何調(diào)控其相關(guān)通路參與肺纖維化的作用仍存在爭(zhēng)議，需進(jìn)一步探討。