外泌體及其與眼科疾病的免疫學關(guān)系

陳熹 陳水蓮 余克明 莊菁

外泌體是一種直徑為30～150 nm的盤狀脂質(zhì)雙層膜小囊泡，是介導細胞-細胞間物質(zhì)運輸、生物分子信息傳遞的橋梁，其免疫學功能備受研究者青睞。多種眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸均與外泌體有關(guān)，部分疾病已被明確證實受外泌體的免疫調(diào)控。本文對外泌體進行基本介紹，并總結(jié)了關(guān)于外泌體與眼科疾病免疫學關(guān)系的研究成果，不僅有利于進一步探究外泌體免疫調(diào)節(jié)作用的分子機制，而且也為外泌體應用于臨床眼科工作的前期研究提供了參考資料。

1 外泌體的生物源性及特性

1.1 來源及構(gòu)成1983年，Harding等[1]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊網(wǎng)織紅細胞在成熟過程中分泌的小囊泡可以向胞外傳遞轉(zhuǎn)鐵蛋白。1987年，Johnstone等[2]將提取出來的小囊泡首次命名為exosomes(外泌體)。隨著對外泌體研究的不斷深入，較多研究發(fā)現(xiàn)淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等多種細胞類型均能分泌外泌體[3-4]，并廣泛存在于血漿、尿液、乳汁、腦脊液、唾液等生物體液中[5-9]。

基于外泌體內(nèi)容物的研究一直是該領(lǐng)域的熱點。截至目前，已在外泌體中發(fā)現(xiàn)9769種蛋白質(zhì)、3408種mRNA、2838種miRNA(http://www.exocarta.org)。就蛋白質(zhì)而言，普遍認為外泌體包含的蛋白質(zhì)按功能可劃分為以下4類：參與膜的運輸與融合(如Rab家族、Annexins、flotillin)；參與多囊泡體的形成(如Alix、TSG101)；熱休克蛋白家族(如HSC70、HSC90)；整合素類與四跨膜蛋白家族(如CD63、CD9、CD81、CD82)。其中部分蛋白質(zhì)由于在外泌體中發(fā)揮作用，豐度明顯高于來源細胞，因此可稱作外泌體標志蛋白(如Alix、flotillin、CD63、TSG101)，并作為分子層面鑒定外泌體的依據(jù)。自Valadi等[10]發(fā)現(xiàn)外泌體中存在mRNA和miRNA以來，越來越多的RNA在外泌體研究中被發(fā)現(xiàn)。不僅如此，針對外泌體中dsDNA[11]和脂質(zhì)[12]的研究也一直在進行。

1.2 形成及分泌機制外泌體的產(chǎn)生始于細胞膜內(nèi)陷，形成早期內(nèi)吞體，隨后早期內(nèi)吞體通過向內(nèi)出芽形成含有多個腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILV)的成熟內(nèi)吞體，即多囊泡體(multivesicular body，MVB)。最終在胞內(nèi)多種分子的作用下，MVB向細胞膜移動并發(fā)生融合，ILV被動釋放至胞外并形成外泌體[13]。

關(guān)于外泌體形成及分泌的分子機制在學界存在爭議。大量研究表明，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)、四跨膜蛋白家族、熱休克蛋白家族、神經(jīng)酰胺、Rab家族等[14-18]均可參與以上過程。但對于各種分子所涉及機制的精確描述以及多種機制能否共存于單一細胞中目前尚未明確。

1.3 功能及發(fā)揮效應機制外泌體的主要功能是運送細胞內(nèi)代謝廢物和介導細胞間信號轉(zhuǎn)導[19]，針對后者的研究更加廣泛。外泌體能夠靶向結(jié)合受體細胞并調(diào)節(jié)細胞間通訊，其作用途徑主要有以下3種：與受體細胞膜表面受體結(jié)合；與受體細胞膜融合；被受體細胞以內(nèi)吞方式攝取[20]。外泌體可通過呈遞新的遺傳信息、直接調(diào)節(jié)信號級聯(lián)反應等方式影響受體細胞表型與功能[21]。來源細胞和受體細胞的種類及生理、病理狀態(tài)將共同決定具體的機制和后續(xù)的細胞命運。

2 外泌體與免疫學的關(guān)系

近年來日益增多的研究表明，多種來源的外泌體能夠有效激活或抑制免疫應答，促進炎癥反應，參與腫瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，具有十分廣泛的免疫學作用[22]。下面將簡單闡述外泌體在眼科范疇內(nèi)發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用，并介紹外泌體與免疫學的兩種特殊關(guān)系：免疫赦免與免疫逃逸。

2.1 免疫調(diào)節(jié)大量研究已經(jīng)證實，外泌體可被多數(shù)免疫細胞(T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等)分泌[3]，如成熟樹突狀細胞分泌的外泌體可以激活CD4+T細胞、CD8+T細胞及未成熟的樹突狀細胞[23]，加強免疫反應效果；而巨噬細胞分泌的外泌體下調(diào)上皮細胞炎癥反應[24]、促進粒細胞遷移的能力[25]也獲得共識。不同來源的外泌體也能靶向作用于免疫細胞。最近一項體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，從永生化視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞系A(chǔ)RPE-19中分離出的外泌體，能夠調(diào)節(jié)單核細胞的表型，正常情況下，外泌體能夠維持單核細胞的非炎癥性穩(wěn)定形態(tài)；而在炎癥因子免疫刺激的情況下，ARPE-19來源的外泌體將削弱單核細胞的免疫活性，減少潛在的免疫反應損害[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)，人RPE細胞分泌的αB-crystallin作為負調(diào)節(jié)因子影響固有免疫[27]，而且外泌體參與這一過程[28]。以上研究證明了源于眼部組織結(jié)構(gòu)的外泌體多呈現(xiàn)免疫負向調(diào)節(jié)，有利于維持眼內(nèi)的免疫抑制微環(huán)境，這可能與下文提到的眼免疫赦免之間存在關(guān)聯(lián)。

2.2 免疫赦免眼免疫赦免是指眼局部正常組織能夠避免因免疫系統(tǒng)炎性攻擊而導致視覺功能喪失的能力。在過去，關(guān)于免疫赦免的研究主要圍繞胎兒及胎盤。早在上世紀就有報道指出：胎盤分泌的FasL能夠通過觸發(fā)局部母體淋巴細胞的清除，從而達到胎盤免疫赦免的目的[29]，F(xiàn)r?ngsmyr等[30]也證實上述過程。隨后，Mckechnie等[31]利用體外實驗，進一步證實了生理狀態(tài)下RPE來源的外泌體能夠攜帶FasL。以上研究成果提示：在血-眼屏障中，外泌體參與的眼免疫赦免可能扮演重要角色，具體的分子機制與胎盤免疫赦免相類似。至于外泌體是否參與了維持眼免疫赦免狀態(tài)的另一個組成部分——前房相關(guān)性免疫偏離，國內(nèi)外鮮有研究報道。

2.3 免疫逃逸正常生理狀況下，免疫系統(tǒng)能夠有效清除體內(nèi)異常細胞，維持機體穩(wěn)定。但是已有研究證實，腫瘤細胞能通過外泌體的協(xié)助，躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，完成免疫逃逸[32]。多種分子機制在非眼科腫瘤中已被證實，如Huber等[33]研究發(fā)現(xiàn)：直腸癌來源的外泌體可利用FasL及TRAIL激活T細胞凋亡通路，發(fā)揮免疫逃逸作用；Taylor等[34]研究也表明：從卵巢癌組織分離出的外泌體可以抑制TCR/CD3f及Jak3等細胞信號分子的表達，從而抑制T細胞活性；Mrizak等[35]還發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌的發(fā)展過程中，外泌體可降低T細胞對IL-2的反應能力，從而導致T細胞分化發(fā)生紊亂。另外還有研究表明，腫瘤源性的外泌體可以通過下調(diào)NKG2D[36]或抑制穿孔素的表達[37]，達到抑制自然殺傷細胞活性、并削弱其細胞毒性的目的。目前，針對眼科腫瘤疾病免疫逃逸的研究相對較少，但其對疾病診治的重要性不容忽視。有研究已證實，F(xiàn)as/FasL在視網(wǎng)膜母細胞瘤中較正常視網(wǎng)膜組織高表達[38]，這說明在視網(wǎng)膜母細胞瘤生長過程中，可能借助FasL發(fā)揮免疫逃逸作用，因此存在外泌體參與其中的可能性。

3 外泌體與眼科疾病的免疫學關(guān)聯(lián)

諸多眼科疾病的發(fā)生以免疫因素為主導，如自身免疫學眼病(如自身免疫性葡萄膜炎)、超敏反應所致眼病(如過敏性結(jié)膜炎)等，而免疫因素也在不同程度上影響眼病的發(fā)展。下面將以不同層次解剖結(jié)構(gòu)(角結(jié)膜、葡萄膜、視網(wǎng)膜)的代表性眼科疾病為例，簡述外泌體在其致病和(或)治療中扮演的免疫學角色。

3.1 角結(jié)膜干燥癥角結(jié)膜干燥癥是指任何原因造成的淚液質(zhì)和(或)量異常或動力學異常，導致淚膜穩(wěn)定性下降并伴有眼部不適和(或)眼表組織病變特征的多種疾病的總稱，常見的病因包括Sj?gren綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)。SS作為一種慢性全身性自身免疫病，能夠使淚腺、唾液腺等多種腺體出現(xiàn)炎性改變及功能紊亂，而淚腺遭到損害即可導致角結(jié)膜干燥癥。目前尚缺乏對外泌體與SS淚腺損害的直接研究，但已有研究人員發(fā)現(xiàn)SS患者體內(nèi)的唾液腺上皮細胞能夠接受B淋巴細胞來源的外泌體，而外泌體所包含的EBV-miR-BART13(一種EB病毒特異性微小RNA)能夠通過抑制Ca2+內(nèi)流通路的激活或者下調(diào)水通道蛋白AQP5的方式，影響外分泌腺的液體分泌[39]。另有研究發(fā)現(xiàn)，唾液腺上皮細胞分泌的外泌體包含自身抗體Ro/SSA、La/SSB、Sm等，能夠激活免疫反應從而造成腺體上皮細胞的損害[40]。淚腺與唾液腺從分子、細胞、組織等各個層次均存在共同點，故可推測上述涉及唾液腺的外泌體研究結(jié)論可能也適用于眼組織，但明確定論還需要進一步證實。

干眼癥若持續(xù)發(fā)展惡化，則出現(xiàn)角膜新生血管的可能性將逐漸提升[41]。這種病理改變的出現(xiàn)往往跟免疫炎癥因子的失衡有關(guān)。已有研究報道：角膜成纖維細胞來源的外泌體可以向血管內(nèi)皮細胞運輸基質(zhì)金屬蛋白酶14(matrix metallo-proteinase-14，MMP-14)，并促進血管生成[42]。因此外泌體中的MMP-14或許能夠作為阻止或逆轉(zhuǎn)角膜新生血管的治療靶點。另外，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)常常在新生血管形成中起到關(guān)鍵作用。但是，這一作用是否與角膜源性外泌體相關(guān)，有待于進一步研究。

3.2 自身免疫性葡萄膜炎自身免疫性葡萄膜炎是臨床常見的致盲性眼病，發(fā)病的主要機制是調(diào)節(jié)性T細胞群失衡[43]。目前臨床上主要是運用免疫抑制劑進行治療，但長期運用容易出現(xiàn)全身性不良反應，并增加青光眼、白內(nèi)障的發(fā)病風險[44]。因此尋求更加安全有效的治療方式仍是自身免疫性葡萄膜炎研究的關(guān)鍵問題?；陂g充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)運用于實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)模型的前期研究[45]，Bai等[46]首次采用MSC分泌的外泌體治療大鼠EAU，并證實了治療的有效性。該研究團隊發(fā)現(xiàn)MSC來源的外泌體能夠抑制T細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞等免疫細胞的趨化與浸潤，而非直接抑制調(diào)節(jié)性T細胞的活性。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了MSC免疫抑制功能的機制，也突顯了外泌體在眼科疾病治療中的潛在應用價值。進一步揭示外泌體作用的分子機制將對其今后的臨床眼科應用有著不容忽視的重要意義。

3.3 年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是導致中老年人視功能嚴重受損的不可逆性致盲性眼病，其主要病理過程包括：RPE細胞代謝功能障礙、Bruch’s膜斷裂、光感受器細胞損傷、脈絡(luò)膜新生血管形成。在視網(wǎng)膜中，RPE-脈絡(luò)膜復合體是視網(wǎng)膜外屏障的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)、功能的完整對于維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。其中，RPE細胞釋放的外泌體可以自由穿透RPE-脈絡(luò)膜毛細血管外屏障，是視網(wǎng)膜內(nèi)外層細胞-細胞之間的信息及物質(zhì)傳遞的橋梁。然而，在不同來源的激活信號(如氧化應激、光損傷等)作用下，RPE細胞來源的外泌體釋放量和內(nèi)容物均發(fā)生明顯改變[47]。這些具有良好生物相容性的小囊泡可以自由穿透RPE-脈絡(luò)膜毛細血管外屏障，并釋放α-crystal蛋白、CD46、CD59等調(diào)節(jié)因子[48]，它能夠活化免疫細胞、激活炎癥、促進細胞遷徙、刺激新生血管生成等，并誘發(fā)光感受器細胞凋亡[49]。以上現(xiàn)象提示，AMD相關(guān)發(fā)病過程中外泌體扮演了重要角色。

趨化因子及受體的生物學作為免疫學的一個分支越來越受到重視。趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)廣泛表達于機體內(nèi)各類細胞，是趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal derived factor-1，SDF-1)的唯一受體蛋白。兩者的特異性結(jié)合在免疫激活、炎癥趨化、造血調(diào)控、胚胎發(fā)育等機體內(nèi)多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在AMD患者的RPE細胞中表達增高[50];而下調(diào)CXCR4表達水平可以顯著抑制激光誘導的脈絡(luò)膜新生血管的形成[51]。以上證據(jù)表明，在病理條件下，SDF-1/CXCR4通路可以被激活，啟動免疫炎癥反應并參與調(diào)控新生血管的形成。另有研究表明，CXCR4高表達細胞分泌的外泌體可以刺激免疫活化，激活炎癥因子，促進血管生成[52]；而在特定生理病理狀態(tài)下，活細胞分泌的外泌體內(nèi)含有的microRNA可以上調(diào)靶細胞CXCR4的表達水平[53]。因此可以推測，SDF-1/CXCR4信號通路和外泌體在促新生血管過程中存在必然聯(lián)系，這無疑為闡明AMD發(fā)病分子機制提供了新的思路。

4 小結(jié)

目前研究表明：外泌體不僅僅參與以上幾種眼科疾病，如外泌體參與青光眼發(fā)病過程已經(jīng)在分子水平得到證實[54]，但青光眼發(fā)展過程中外泌體如何發(fā)揮免疫學作用有待更深入的研究。外泌體與白內(nèi)障、斜視、弱視等其他諸多眼科疾病的免疫學關(guān)聯(lián)尚不確切；對于角膜、眼底新生血管，外泌體憑借哪些信號通路造成影響也缺乏共識。因此，著重于外泌體與眼部疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制的探討有著廣闊的前景。

另外，基于外泌體的無細胞治療逐漸成為熱點，諸多研究團隊都在積極探索外泌體治療包含的復雜免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。外泌體較細胞而言更加穩(wěn)定且易于保存，作為眼科疾病免疫學治療的新型生物產(chǎn)品，它具有很大的臨床應用價值，而進一步探討其安全性是其臨床應用的必要前提。