細(xì)胞外基質(zhì)在皮膚組織創(chuàng)面修復(fù)中的研究進(jìn)展

劉青武 何秀娟 張金超 林 燕 李 萍

人類皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子物質(zhì)，主要是水、蛋白質(zhì)、蛋白聚糖和多糖。ECM支持并連接組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)組織的生長和細(xì)胞的生理活動(dòng)，其在機(jī)體發(fā)育、組織動(dòng)態(tài)平衡及創(chuàng)面修復(fù)中起著重要作用。為便于了解ECM用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)治療的研究現(xiàn)狀，現(xiàn)將近年研究進(jìn)展綜述如下。

一、ECM的結(jié)構(gòu)和作用

1.ECM的結(jié)構(gòu):ECM是由纖維蛋白和基質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維蛋白主要有膠原蛋白、彈性蛋白和纖維粘連蛋白，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中主要的蛋白質(zhì)，Ⅰ～Ⅲ型膠原蛋白含量最豐富，Ⅰ型膠原具有很強(qiáng)的抗張強(qiáng)度，Ⅱ型膠原主要分布于軟骨中，Ⅲ型膠原形成細(xì)微的膠原纖維網(wǎng)，廣泛分布于疏松結(jié)締組織。纖維蛋白將細(xì)胞粘連在一起構(gòu)成組織，并提供細(xì)胞外網(wǎng)架，維持細(xì)胞形態(tài)。而基質(zhì)成分主要包括蛋白聚糖和糖胺聚糖，在纖維蛋白的周圍形成凝膠狀物質(zhì)，參與細(xì)胞間及細(xì)胞與ECM的相互作用，對(duì)細(xì)胞活性有一定影響[1]。

2.ECM的作用:皮膚作為機(jī)體屏障的能力，主要由維持皮膚連續(xù)性和完整性并在受傷后修復(fù)皮膚的細(xì)胞決定。皮膚修復(fù)依賴于多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的功能活動(dòng)，涉及多種調(diào)節(jié)，包括生長因子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞受體和ECM成分等。ECM作為皮膚細(xì)胞生存的微環(huán)境，不僅對(duì)組織細(xì)胞起支持保護(hù)和營養(yǎng)作用，還與細(xì)胞的增殖、分化、代謝、識(shí)別、黏著及遷移等基本生命活動(dòng)密切相關(guān)。ECM影響著干細(xì)胞/祖細(xì)胞的細(xì)胞極性、屏障功能及其微環(huán)境，以適應(yīng)細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移等不同需求。ECM組分中的蛋白質(zhì)家族可以相互作用，比如，纖維粘連蛋白具有與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)，而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路及細(xì)胞功能的改變。在急性皮膚創(chuàng)傷時(shí)，膠原蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖取代臨時(shí)ECM，參與肉芽組織的形成，大量ECM的聚集，刺激表皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)傷口再表皮化[2]。ECM的組分可調(diào)節(jié)生長因子的釋放、血管再生、組織病理改變和炎性應(yīng)答等，對(duì)于機(jī)體修復(fù)和再生有非常重要的作用，是決定修復(fù)質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。

在廣泛的燒傷及其他全層皮膚傷口中，如糖尿病潰瘍、嚴(yán)重?zé)齻湍鲜中g(shù)治療惡性腫瘤等，往往涉及皮膚移植，比如自體、同種異體、異種皮膚移植物等。但由于自體皮膚有限，移植后產(chǎn)生繼發(fā)缺損、瘢痕，異體移植物免疫反應(yīng)以及各種疾病風(fēng)險(xiǎn)等缺陷，引起了臨床對(duì)更先進(jìn)皮膚替代品的需求。ECM可來源于人體、動(dòng)物(牛、豬等)、植物等，這些材料被稱為生物支架[3]。隨著基因工程、組織工程的迅速發(fā)展，利用基因技術(shù)、組織工程皮膚技術(shù)將ECM用于修復(fù)全層皮膚創(chuàng)口，已經(jīng)成為創(chuàng)傷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

二、脫細(xì)胞組織或器官來源的ECM

脫細(xì)胞組織或器官來源的ECM的機(jī)械結(jié)構(gòu)及生物功能，與天然組織非常相似，而脫細(xì)胞的目的就是去除潛在的免疫應(yīng)答的細(xì)胞組分，為宿主細(xì)胞和血管的生長，提供良好生物相容性的生物支架[4]。因此，脫細(xì)胞生物材料可更好的刺激局部環(huán)境修復(fù)組織，無需基于細(xì)胞療法的監(jiān)管和科學(xué)挑戰(zhàn)。目前組織或器官脫細(xì)胞的方法包括化學(xué)法、酶法和機(jī)械法，化學(xué)法是用表面活性劑或酸堿破壞細(xì)胞形態(tài)而去細(xì)胞，機(jī)械法通過凍融、超臨界二氧化碳或提供高靜水壓的方式使組織細(xì)胞膨脹破裂，留下基本上由ECM成分組成的材料[5]。不同的脫細(xì)胞方法決定了ECM保留成分及數(shù)量的不同，影響ECM的生物學(xué)活性。但普通化學(xué)法、酶法和機(jī)械法脫細(xì)胞的方法存在著遺傳物質(zhì)(DNA)去除不完全或ECM成分損失或生物活性受損等缺點(diǎn)[6]。郭寶林等[7]使用磷脂酶A2-脫氧膽酸鈉(phospholipase A2-sodium deoxycholate，PLA2-SDC)復(fù)合脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)、核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)的去細(xì)胞方法，制備的ECM無遺傳物質(zhì)保留，而且膠原、膠原層連蛋白和纖連蛋白等保存良好，該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作時(shí)間短，ECM成分暴露時(shí)間短，對(duì)ECM的生物活性影響小，這種改良的酶脫細(xì)胞法為ECM支架的提取提供了新的思路。

1.人胎盤來源的ECM:人胎盤含有豐富的ECM成分和保存完好的多種內(nèi)源性生長因子，如胰島素樣生長因子-1、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子-2、血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β等，這些細(xì)胞因子通過胎盤傳遞給胎兒，在促進(jìn)胎兒發(fā)育中起重要作用。此外，胎盤的抗炎、抗菌、低免疫原性、抗痙攣和傷口保護(hù)等生物學(xué)特性，使其成為治療燒傷皮膚、腿部潰瘍和眼科疾病的理想材料。

Choi等[8]利用人胎盤制造多孔的脫細(xì)胞ECM片，其中含有來自胎盤的各種保存完好的蛋白質(zhì)和生物活性分子，并將其用于治療兔全層皮膚傷口。在早期階段，ECM片有效地吸收傷口滲出物，并緊密附著在傷口表面。植入后數(shù)周，傷口完全閉合，表皮細(xì)胞排列整齊，表皮和真皮的雙層結(jié)構(gòu)恢復(fù)，并形成新的毛囊和微血管?？傮w而言，ECM片是具有與正常皮膚組織相似的真皮替代物，人胎盤衍生的ECM片提供有利于細(xì)胞生長和分化的微環(huán)境，從而促進(jìn)全層傷口的愈合。Rameshbabu等[9]在胎盤ECM中加入絲素蛋白，改進(jìn)其機(jī)械性能，制成的多孔復(fù)合ECM海綿。在體外實(shí)驗(yàn)中，多孔復(fù)合ECM海綿能促進(jìn)人包皮成纖維細(xì)胞、人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和人羊膜來源的干細(xì)胞的黏附、滲透、增殖和遷移。此外，在大鼠全層傷口模型中植入多孔復(fù)合ECM海綿，明顯的促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)肉芽組織形成和早期再上皮化，改善表皮-真皮連接的愈合。另外，皮下植入的多孔復(fù)合ECM海綿，對(duì)宿主沒有嚴(yán)重的免疫應(yīng)答。說明具有優(yōu)異物理機(jī)械性質(zhì)和細(xì)胞因子裝飾的多孔復(fù)合ECM海綿，可以是全厚度皮膚傷口的合適皮膚替代物。

2.膽囊來源ECM：膽囊細(xì)胞來源的ECM是一種新型的無細(xì)胞蛋白質(zhì)可降解生物材料，該基質(zhì)富含膠原蛋白。膽囊源性ECM被證明可用于胃腸切除術(shù)和吻合術(shù)，還具有類似于心臟瓣膜的微結(jié)構(gòu)，支持瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖。

Poonam等[10]從豬膽囊中提取了膽囊源性ECM，并比較了其與市售膠原片，在大鼠全厚皮膚創(chuàng)面的愈合潛力，發(fā)現(xiàn)膽囊源性ECM通過增加切除傷口中的細(xì)胞增殖、新血管形成、膠原合成及上皮形成，增強(qiáng)傷口愈合活性，對(duì)大鼠全層皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)效果優(yōu)于市售膠原片。Shakya等[11]使用陰離子生物洗滌劑制備源自牛脫細(xì)胞膽囊ECM，并發(fā)現(xiàn)牛脫細(xì)胞膽囊ECM比空白組創(chuàng)面更顯著的促進(jìn)傷口收縮、促進(jìn)表皮及新血管、纖維組織的增生，再次證明膽囊源性ECM具有修復(fù)全層皮膚傷口的潛力。

3.豬皮來源ECM：郭寶林等[7]將脫細(xì)胞豬皮ECM用于小鼠全層皮膚損傷模型，經(jīng)組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)生理鹽水組小鼠第28天時(shí)，創(chuàng)口愈合，而豬皮ECM創(chuàng)口在14天時(shí)愈合，豬皮ECM組創(chuàng)傷愈合速度有顯著提高。證實(shí)了ECM在創(chuàng)傷愈合中的促進(jìn)作用，脫細(xì)胞豬皮ECM也可以作為一種良好的皮膚支架材料。

4.綿羊膀胱來源ECM：Zihayat等[12]從綿羊膀胱中提取ECM，觀察了綿羊膀胱ECM在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合中的作用，并與外用凡士林及對(duì)照組比較，ECM處理的動(dòng)物創(chuàng)面面積和創(chuàng)面愈合率均有顯著改善(P<0.01)，ECM處理的傷口上皮化得更快。這與綿羊膀胱ECM所含的透明質(zhì)酸(HA)、膠原蛋白、彈性蛋白和生長因子，增加了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移而促進(jìn)再上皮化有關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究來闡明ECM傷口愈合的確切機(jī)制。

5.胎牛來源ECM：Neill等[3]用胎牛膠原(bovine fetal collagen，BFC)治療9例難愈性全層皮膚傷口的患者，并觀察了植入BFC后取得的活檢標(biāo)本中BFC的生物反應(yīng)。結(jié)果在植入2周后，BFC中見成纖維維細(xì)胞增生、新血管形成及疏松的嗜酸、淋巴細(xì)胞浸潤，未見中性粒細(xì)胞。隨著植入時(shí)間的增長，在27天時(shí)，BFC中的成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多?；颊咭浦睟FC治療時(shí)間最長的是9個(gè)月，BFC的膠原結(jié)構(gòu)已經(jīng)與正常膠原類似，移植區(qū)域未見明顯瘢痕。但與其他患者不同的是，來自1例患有凝血功能障礙的肝衰竭患者的移植物，由于受患者機(jī)體環(huán)境的影響，在20天時(shí)可見急性炎性反應(yīng)。說明BFC在大多數(shù)情況下，對(duì)宿主的組織耐受性較好，允許炎性細(xì)胞的遷移，支持肉芽組織的形成，有助于慢性傷口的愈合，但宿主和傷口因素也可能通過尚不清楚的機(jī)制導(dǎo)致BFC的功能障礙。所以，Neill等[3]建議在臨床使用BFC時(shí)，BFC組織學(xué)的特征應(yīng)當(dāng)由參與患者創(chuàng)面治療的病理學(xué)專家評(píng)定。

三、ECM作為干細(xì)胞載體

干細(xì)胞療法提供了一種有希望的新技術(shù)來促進(jìn)傷口愈合，但干細(xì)胞移植后，常常出現(xiàn)死亡或從傷口部位遷移，大大降低了治療效果。而局部應(yīng)用具有抗氧化作用的化合物，可顯著改善傷口愈合過程并保護(hù)組織免受氧化損傷。脫細(xì)胞ECM可能是一種抗氧化治療方法，可以預(yù)防移植的間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化損傷，對(duì)傷口愈合具有良好的效果[13]。

豬小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)作為一種運(yùn)載工具，具有天然的ECM成分，包括其膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，可為干細(xì)胞提供了合適的生存環(huán)境。Lam等[14]使用源自豬小腸黏膜下層的ECM貼片材料將脂肪來源的干細(xì)胞引入小鼠皮膚切口。并使用生物發(fā)光體內(nèi)成像所證實(shí)，單獨(dú)移植至皮膚傷口的干細(xì)胞在移植后不能存活，相反，使用貼片進(jìn)行遞送，則使干細(xì)胞增殖和存活顯著增加，并且與未治療的傷口比較，在貼片上用干細(xì)胞處理的傷口中纖維化的區(qū)域(表明瘢痕形成)顯著減少。由于貼片是一種非侵入性地提供干細(xì)胞治療的方法，可以進(jìn)一步嘗試與各種干細(xì)胞聯(lián)合治療其他類型的傷口。

四、ECM水凝膠

人類脂肪組織來源豐富，并含有豐富的ECM蛋白和可溶性生長因子，故常用作ECM來源。

Kim等[15]報(bào)告了基于人脂肪來源的可溶性ECM(soluble ECM, sECM)和甲基纖維素(methylcellulose, MC)形成的熱敏水凝膠，可通過注射以遞送干細(xì)胞。將提取的sECM與MC混合，可以改善熱敏水凝膠的機(jī)械性能。sECM-MC水凝膠的特征在于sECM含量、流變性質(zhì)和嵌入干細(xì)胞的能力。在小鼠全厚皮膚傷口中單次注射干細(xì)胞水凝膠后，傷口通過重新上皮化和新生血管化而迅速愈合，瘢痕形成最小。表明sECM-MC水凝膠是一種很有前途的干細(xì)胞遞送和組織再生的可注射載體，代表了水凝膠可以作為一種新型的生物支架方法。Zhu等[16]通過將透明質(zhì)酸和羧化殼聚糖加入到人類膠原中制成水凝膠制劑，發(fā)現(xiàn)水凝膠促進(jìn)了小鼠成纖維細(xì)胞的黏附、增殖和遷移，有利于促進(jìn)傷口愈合。其表現(xiàn)出良好的皮膚修復(fù)、藥物遞送的潛力。但關(guān)于水凝膠刺激傷口愈合的機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。

五、大豆蛋白/纖維素納米纖維支架仿制的皮膚ECM

模擬ECM的生物支架，具有能夠支持參與再生的細(xì)胞生長的生物活性分子。大豆蛋白是從大豆中提取的一種膳食蛋白，具有類似于人體組織ECM蛋白的生物活性肽，這些ECM模擬肽可以促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和遷移，支持組織再生。大豆蛋白含有植物雌激素，可作為雌性激素的結(jié)構(gòu)和功能類似物。大豆蛋白中的生物活性肽可增加皮膚ECM合成，促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化[17]。大豆植物雌激素通過雌激素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，加速愈合過程，它還具有抗細(xì)菌、抗炎和抗氧化特性。大豆蛋白質(zhì)和植物雌激素的口服攝入，可加速老年女性和燒傷患者的皮膚再生[18]。

Ahn等[19]利用旋轉(zhuǎn)噴射紡絲技術(shù)，開發(fā)一種由醋酸纖維素(cellulose acetate, CA)和大豆蛋白水解物(soy protein hydrolysate, SPH)組成的完全植物納米纖維敷料。紡絲納米纖維成功地模擬了天然皮膚ECM的理化性質(zhì)，并表現(xiàn)出高保水性能。由于其非動(dòng)物來源，可避免動(dòng)物源性蛋白的免疫原性、疾病傳播和病原體污染等缺點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，與聚己內(nèi)酯和CA納米纖維比較，CA/SPH納米纖維可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、生長、遷移、浸潤和整合素β1的表達(dá)，并表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性。在體內(nèi)，CA/SPH納米纖維比CA納米纖維或未處理的對(duì)照組比較，能加速傷口愈合和組織再生，并以類似于其他纖維支架的方式減少瘢痕形成。這些結(jié)果證實(shí)了CA/SPH納米纖維作為一種新型傷口敷料的愈合潛力，來源于植物基質(zhì)的可再生支架可能成為下一代可再生敷料的研究方向。

六、其 他

1.胎盤生長因子(PIGF-2)序列：生長因子是一類通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和功能的多肽類物質(zhì)。通過增強(qiáng)生長因子與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。

Martino等[20]發(fā)現(xiàn)了位于胎盤生長因子(placental growth factor, PIGF-2)上的一個(gè)包含22個(gè)氨基酸的區(qū)域，能增強(qiáng)PIGF-2與ECM蛋白質(zhì)的結(jié)合力。Martino將該結(jié)構(gòu)域與血管內(nèi)皮生長因子-A、血小板衍生生長因子-BB和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2融合而成的工程化生長因子對(duì)比未經(jīng)修飾的生長因子顯示出了更強(qiáng)的ECM親和力，更快的促進(jìn)了新血管形成和肉芽組織的生長，促進(jìn)傷口愈合，從而大大提高了生長因子對(duì)組織損傷修復(fù)的能力。

2.縫隙連接蛋白43(connexin, Cx43):縫隙連接在1967年首次在肝細(xì)胞中被描述。目前，在人和嚙齒動(dòng)物皮膚中已經(jīng)鑒定出多達(dá)10個(gè)不同的連接蛋白家族成員。用Cx43反義寡脫氧核苷酸處理的受傷和燒傷的小鼠皮膚表現(xiàn)出加速的傷口愈合，增強(qiáng)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖以及成纖維細(xì)胞的遷移增加和更顯著的膠原沉積，這提示抑制連接蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的[21]。Cogliati等[22]利用雜合子Cx43敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)Cx43缺乏可促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖和活化，從而促進(jìn)再上皮化和創(chuàng)面愈合，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑因子的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)再次證實(shí)了Cx43在皮膚創(chuàng)傷愈合中可能是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，ECM含有多種有益于細(xì)胞增殖的成分，在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中具有重要作用，目前通過基因工程，特別是組織工程皮膚技術(shù)，已能夠?qū)⑼N、異種或植物成分ECM用于人或動(dòng)物的創(chuàng)面修復(fù)，并顯示了較好的修復(fù)效果。但是，關(guān)于ECM修復(fù)人的皮膚創(chuàng)面的研究仍較少，需要廣大研究者深入探索。