細(xì)胞自噬在骨髓增生異常綜合征發(fā)病機制中的作用

王冬琴，許 鳴，陸嘉惠※

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院血液科，上海 200071； 2.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，浙江 桐鄉(xiāng) 314500)

細(xì)胞自噬是細(xì)胞將胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解的過程，其水平變化與感染、衰老、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病和腫瘤等生命過程密切相關(guān)。根據(jù)底物運送到溶酶體腔方式的不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬3種，其中巨自噬是目前研究最廣泛的一種自噬形式。在正常情況下，自噬為細(xì)胞提供能量，有利于細(xì)胞保持自我穩(wěn)態(tài)，是程序性細(xì)胞死亡的形式之一。在發(fā)生應(yīng)激時，自噬主要通過維持基因組完整性和預(yù)防增殖及炎癥發(fā)揮細(xì)胞防御機制，細(xì)胞主要表現(xiàn)為自噬水平升高以防止有毒或致癌的損傷蛋白質(zhì)和細(xì)胞器累積及抑制細(xì)胞死亡[1]。然而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，自噬不僅可以產(chǎn)生保護性作用，為癌細(xì)胞提供更豐富的營養(yǎng)以維持細(xì)胞生長和增殖，還可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[2]。骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是起源于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)的一組高度異質(zhì)性克隆性疾病，以一系或多系血細(xì)胞病態(tài)造血及無效造血、高風(fēng)險向急性白血病轉(zhuǎn)化為特征。MDS的發(fā)病機制至今仍不明確。研究表明，HSC的自噬缺陷可導(dǎo)致受損線粒體的堆積、代謝產(chǎn)物(活性氧類)增多造成細(xì)胞損傷及基因不穩(wěn)定，最終誘導(dǎo)具有MDS表型的細(xì)胞增殖，甚至進展為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[3]。現(xiàn)就細(xì)胞自噬在MDS發(fā)病機制中的作用予以綜述。

1 自噬缺陷與MDS

1.1線粒體自噬缺陷導(dǎo)致紅系成熟障礙 作為細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，線粒體在真核生物細(xì)胞的生長、增殖分化和死亡等生命活動中發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用。線粒體損傷是許多人類疾病的直接誘因，而線粒體自噬是細(xì)胞清除受損、功能失調(diào)和終末分化過程中線粒體的過程，也是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的一種重要調(diào)節(jié)機制。細(xì)胞出現(xiàn)自噬缺陷，可引起損傷和老化線粒體的大量聚集及細(xì)胞分化后期線粒體清除不足，從而促進腫瘤的發(fā)展。有文獻報道，線粒體缺陷和紅細(xì)胞成熟障礙是低危MDS難治性貧血的重要特征，功能缺陷的線粒體又能夠誘導(dǎo)活性氧類水平升高導(dǎo)致DNA損傷，使細(xì)胞癌變或異常增殖，從而引起白血病[4-5]。Houwerzijl等[6]的研究表明，MDS中低?；颊呒t系分化的早期階段，幼紅細(xì)胞較正常細(xì)胞具有更強的自噬特征，增強的自噬可能是一種細(xì)胞保護機制，可以去除有缺陷的含鐵線粒體，防止自噬底物的增加對細(xì)胞造成進一步的損傷，從而造成高風(fēng)險MDS的發(fā)生。此外，中高危MDS貧血患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)異常線粒體高度累積，其外膜蛋白Nix介導(dǎo)的線粒體自噬功能缺陷使得紅細(xì)胞無法去除多余線粒體形成雙凹面的成熟紅細(xì)胞[7-8]。Sandoval等[9]在Nix敲除(Nix-/-)貧血小鼠模型中發(fā)現(xiàn)受損線粒體無法進入自噬體的現(xiàn)象。

1.2Beclin-1依賴性自噬減少抑制骨髓單個核細(xì)胞死亡 酵母自噬相關(guān)基因的哺乳動物同系物Beclin-1是第一種被發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤的自噬基因。雖然中低危MDS患者的骨髓CD34+細(xì)胞異常增生并出現(xiàn)病態(tài)造血，但這類細(xì)胞仍具有一定正常功能，可通過自噬水平的升高將受損的細(xì)胞器、DNA降解后重新利用。有文獻報道，中低危MDS患者骨髓單個核細(xì)胞中的Beclin-1信使RNA和蛋白表達水平顯著高于非腫瘤血液病患者，高危MDS患者及AML患者骨髓單個核細(xì)胞中的Beclin-1水平明顯低于中低危MDS患者和正常人，提示Beclin-1依賴性自噬減少為MDS的發(fā)病和進展機制之一[10]。Pattingre等[11]對在哺乳動物和酵母中過表達抗凋亡蛋白Bcl-2進行研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2減少了Beclin-1的表達，相反突變型Bcl-2不能減少Beclin-1的表達，表明Beclin-1依賴性自噬受Bcl-2抑制。另外有研究顯示，骨髓單個核細(xì)胞中Bcl-2的表達隨著MDS危度上升而增加，故推測MDS中高表達的Bcl-2可能抑制Beclin-1依賴性自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少[12]。

1.3自噬缺陷增加MDS向急性白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險 高危MDS患者骨髓單個核細(xì)胞內(nèi)低度的自噬活性使得細(xì)胞無法及時清除自身代謝產(chǎn)生的活性氧類，從而進一步造成DNA損傷。Goncalves等[13]對40例MDS患者和10名正常人骨髓單個核細(xì)胞中的活性氧類水平與DNA損傷進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MDS患者中導(dǎo)致高水平活性氧類產(chǎn)生的CYBA、谷胱甘肽過氧化物酶1和超氧化物歧化酶2基因表達增加，且高水平的活性氧類與修復(fù)DNA損傷的NEIL1(nei like DNA glycosylase 1)和8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶基因突變呈正相關(guān)，而NEIL1和8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶的突變是MDS向AML轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。同時，高水平的活性氧類還能抑制負(fù)性調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白C1自噬通路的腫瘤抑制因子人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的活性，從而抑制其激活Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶促進自噬或促進其活化蛋白激酶B抑制自噬。有研究顯示，難治性貧血伴原始細(xì)胞過多MDS患者骨髓單個核細(xì)胞的人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因蛋白表達水平顯著低于難治性血細(xì)胞減少伴多系病態(tài)造血MDS患者，而高危MDS患者骨髓及外周血單個核細(xì)胞中的原癌基因產(chǎn)物蛋白激酶B水平較低危MDS患者顯著升高，其原因可能為人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的缺失[14]。

2 細(xì)胞自噬與MDS發(fā)生

MDS的發(fā)病機制涉及HSC、骨髓微環(huán)境和基因表達異常，這3種致病機制可相互影響，促進MDS的發(fā)生、發(fā)展，給MDS的病因診斷增加更多阻礙。異常的自噬除影響HSC外，還可通過影響骨髓微環(huán)境或被表觀遺傳所調(diào)控參與或影響MDS的發(fā)生、發(fā)展。

2.1自噬與HSC穩(wěn)態(tài)

2.1.1自噬調(diào)控HSC靜息態(tài) MDS是HSC克隆性疾病。在正常狀態(tài)下，大部分HSC處于靜息狀態(tài)，僅有極少的HSC分化成各系成熟的血細(xì)胞，而靜息態(tài)的HSC儲備可防止細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致白血病細(xì)胞生成、干細(xì)胞衰竭和造血譜系不能再生。HSC進入靜息狀態(tài)通常與代謝變化相關(guān)，與增殖細(xì)胞需要更多的代謝用于生物合成相比，靜息態(tài)HSC主要依靠糖酵解而非線粒體氧化磷酸化供能維持細(xì)胞基礎(chǔ)代謝，以緩解骨髓大量的代謝需求和避免過度活性氧類積累從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，因此其胞內(nèi)線粒體水平極低。因自噬參與靜息態(tài)HSC清除多余線粒體和降解受損細(xì)胞器及蛋白質(zhì)等代謝廢物的循環(huán)利用過程，故其水平通常會隨年齡的增長而降低。Gomez-Puerto等[3]的研究證實，靜息態(tài)HSC中的自噬通量明顯高于分裂期細(xì)胞。此外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白是抑制自噬的受體蛋白和HSC自我更新的重要調(diào)節(jié)因子，其過度活化會使HSC內(nèi)的活性氧類水平上升從而破壞HSC的靜息狀態(tài)，使HSC過早衰竭，但用抗氧化劑和自噬激活劑雷帕霉素處理HSC能抑制胞內(nèi)活性氧類水平升高和過度活化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號，進而促進HSC體外擴增及造血重建[15]。

2.1.2自噬調(diào)控HSC增殖分化 MDS存在HSC增殖分化異常，在HSC的增殖和分化過程中涉及諸多調(diào)控因素，干細(xì)胞基因程序性表達、細(xì)胞因子和造血微環(huán)境等均能影響HSC的定向分化。自噬是細(xì)胞體內(nèi)平衡和重構(gòu)必需的代謝過程，研究表明其廣泛參與HSC增殖分化過程[16]。Gomez-Puerto等[3]發(fā)現(xiàn)，選擇性敲除小鼠HSC自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)5或ATG7能夠?qū)е录?xì)胞周期縮短、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活性氧類水平升高，且過度的活性氧類可損傷DNA進而誘導(dǎo)HSC異常增殖分化，喪失正常的造血能力，出現(xiàn)嚴(yán)重的髓性增生甚至具有AML表型的HSC。GATA-1作為HSC向紅系分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能與叉頭框蛋白O3A一起調(diào)控自噬相關(guān)基因表達及溶酶體合成，其與自噬基因的表達隨著紅系分化逐漸增加，在紅細(xì)胞成熟后期線粒體的清除中發(fā)揮重要作用。此外，Cao等[17]發(fā)現(xiàn)自噬的喪失導(dǎo)致HSC線粒體和細(xì)胞周期功能障礙，從而阻礙巨核細(xì)胞生成和分化，最終產(chǎn)生異常的血小板。同時，Huang等[18]也發(fā)現(xiàn)ATG9B、SHC1是HSC向單核細(xì)胞和粒細(xì)胞增殖分化過程中的重要調(diào)節(jié)因子。

2.2自噬與骨髓造血微環(huán)境

2.2.1自噬調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)的增殖分化和凋亡 BMSC是骨髓微環(huán)境的關(guān)鍵成分之一，對HSC不僅有機械支持作用，還具有分泌多種生長因子(白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-11及巨噬細(xì)胞集落刺激因子等)精細(xì)調(diào)控HSC以使其保持終身造血的能力。與成骨細(xì)胞相比，BMSC有更強的自噬特征，而與處于增殖階段的BMSC相比，處于分化階段的BMSC自噬水平會進一步升高，高水平的自噬可以降低細(xì)胞分化期間由糖酵解供能轉(zhuǎn)換為線粒體代謝所升高的活性氧類水平，防止其過度積累造成BMSC損傷[19]。同時，保持較高水平的自噬也可以防止BMSC 在骨髓缺氧環(huán)境下過度凋亡[20]，這與Liu等[21]模擬骨髓低氧條件并用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤處理小鼠BMSC的實驗結(jié)果一致。另外，使用3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素分別處理年輕人和老年人的BMSC后發(fā)現(xiàn)，其成骨分化和增殖能力分別有相應(yīng)程度的抑制和促進，表明自噬在BMSC衰老中也發(fā)揮重要作用[22]。目前，雖沒有直接證據(jù)表明MDS患者與正常人的BMSC自噬水平有差別，但自噬能夠調(diào)控BMSC的增殖分化、衰老和凋亡，故其水平變化必然會改變BMSC的功能，從而導(dǎo)致MDS的發(fā)生。

2.2.2自噬調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的促凋亡效應(yīng) TGF-β參與調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、凋亡和自噬。Geyh等[23]發(fā)現(xiàn)，TGF-βⅠ受體激酶的抑制劑能夠消除TGF-β對BMSC功能的抑制，同時暴露于TGF-β后，正常人的BMSC可出現(xiàn)與MDS和AML患者來源BMSC表型相似的功能缺陷，故認(rèn)為TGF-β是引發(fā)MDS和AML的最可能的外在觸發(fā)因子。Suzuki等[24]發(fā)現(xiàn)，TGF-β與自噬之間有雙向調(diào)控作用，其不僅能通過Smad和c-Jun氨基端激酶途徑誘導(dǎo)ATG5、ATG7和Beclin-1表達促進自噬；另外，沉默自噬基因的表達也可以抑制TGF-β的生長抑制功能和下調(diào)其介導(dǎo)的促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim的表達。同時有研究表明，MDS患者的Bim表達顯著減少[25]，推測MDS骨髓單個核細(xì)胞中較低的自噬水平可能抑制骨髓環(huán)境中高表達的TGF-β的促凋亡效應(yīng)。

2.3自噬與表觀遺傳學(xué)

2.3.1組蛋白修飾調(diào)控自噬 組蛋白H3/H4的甲基化和乙?；揎棻徽J(rèn)為是MDS發(fā)病的重要表觀遺傳學(xué)機制。自噬過程包括轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳程序，因此自噬和組蛋白功能的異常與MDS發(fā)病密切相關(guān)。由于DNA甲基化變化具有潛在的可逆性，故阿扎胞苷和地西他濱等DNA去甲基化和組蛋白干預(yù)藥物在MDS治療中的應(yīng)用也逐漸增多?，F(xiàn)有文獻報道，使用阿扎胞苷或地西他濱處理MDS細(xì)胞系SKM-1后細(xì)胞表現(xiàn)出更強的自噬特征[26]。啟動子區(qū)高水平的組蛋白H3賴氨酸4三甲基化可導(dǎo)致MDS患者骨髓CD34+細(xì)胞中大量轉(zhuǎn)錄因子尤其是核因子κB的異常表達。核因子κB是一種抗凋亡蛋白，F(xiàn)abre等[27]使用核因子κB抑制劑BAY11-7082處理MDS骨髓細(xì)胞后，在細(xì)胞核凋亡之前觀察到細(xì)胞質(zhì)中存在許多自噬泡。同時陸嘉惠等[28]進一步研究發(fā)現(xiàn)，低危組MDS細(xì)胞中核因子κB活化水平下降，凋亡增加，高危組MDS細(xì)胞中核因子κB活化水平升高，凋亡減少。另有研究顯示，組蛋白H3 賴氨酸4、組蛋白H3賴氨酸9和組蛋白H4賴氨酸16等在被修飾的同時也調(diào)控自噬水平[29]，其中組蛋白H3賴氨酸9雙甲基化參與自噬的早期階段，組蛋白H4賴氨酸16乙?；较陆悼赏ㄟ^下調(diào)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶表達水平參與自噬的晚期階段[30]。此外，去乙酰化酶抑制劑伏立諾他能夠提高組蛋白H3/H4的乙?；剑傻萚31]使用伏立諾他處理MDS細(xì)胞SKM-1后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和Beclin-1蛋白的表達明顯增加。

2.3.2微RNA(microRNA，miRNA)調(diào)控自噬 miRNA通過誘導(dǎo)靶信使RNA降解或抑制靶信使RNA的翻譯實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過直接或間接的方式參與自噬過程的自噬誘導(dǎo)、自噬囊泡成核、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體降解5個階段[32]。自噬泡的延伸涉及ATG5-ATG12-ATG16泛素化蛋白結(jié)合系統(tǒng)，而miR-181a能夠靶向抑制自噬基因ATG5的表達阻礙ATG5-ATG12-ATG16多聚體形成，減少細(xì)胞自噬[33]。Santamaria等[34]使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法證實，miR-181a在MDS來源的BMSC中表達下調(diào)，下調(diào)的miR-181a可能導(dǎo)致BMSC出現(xiàn)自噬性死亡，從而使其失去精細(xì)調(diào)控HSC的能力導(dǎo)致MDS。

除能直接靶向調(diào)節(jié)自噬關(guān)鍵基因表達的 miRNA 外，還有一些能間接調(diào)控自噬調(diào)節(jié)因子的miRNA可能參與MDS的發(fā)病。其中，miR-195可通過靶向下調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)子1介導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬性凋亡作用，Xu等[35]通過半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)與正常對照者相比，MDS患者的miR-195-5p水平上調(diào)。同時，Sun等[36]在MDS異常克隆的HSC內(nèi)發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)子1蛋白表達水平顯著降低，故推測MDS腫瘤細(xì)胞內(nèi)高水平的miR-195-5p能夠靶向沉默信息調(diào)節(jié)子1促進細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

3 小 結(jié)

細(xì)胞自噬是細(xì)胞在惡劣生存條件下的應(yīng)激反應(yīng)，其不僅可以影響HSC增殖分化和健康骨髓微環(huán)境，還可以被表觀遺傳調(diào)控在MDS的發(fā)病機制中產(chǎn)生一定的作用。臨床上，雖無明確自噬誘導(dǎo)分類的藥物用于MDS的治療，但已廣泛用于中高危MDS患者的誘導(dǎo)沉默腫瘤抑制基因再表達的去甲基化藥物(阿扎胞苷和地西他濱)治療作用機制的研究證實，去甲基化藥物能夠提高腫瘤細(xì)胞的自噬水平發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[26]。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理總局已經(jīng)批準(zhǔn)了氯喹、羥氯喹、雷帕霉素等多種自噬相關(guān)調(diào)節(jié)劑在實體腫瘤和血液惡性腫瘤，以及自噬調(diào)節(jié)劑與傳統(tǒng)化療方式聯(lián)合治療慢性髓系白血病中的臨床研究，這為如何有效聯(lián)合運用自噬調(diào)節(jié)劑與現(xiàn)有MDS治療手段提供了參考。此外，當(dāng)前的MDS治療藥物無法完全清除腫瘤細(xì)胞，未來應(yīng)研究如何利用自噬調(diào)節(jié)劑增強藥物對MDS細(xì)胞的殺傷作用。