miR-7在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展

羅 雨，秦安成，黃 海，錢偉峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215000)

結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率逐年上升[1-2]。對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者，現(xiàn)有的治療手段療效一般，因此迫切需要尋找療效更佳的治療方法。為尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制很有必要。近年來，微RNA(microRNAs，miRNA)的出現(xiàn)給結(jié)直腸癌的治療、監(jiān)測(cè)及診斷提供了新的方向。人們對(duì)miRNAs 在結(jié)直腸腫瘤以及相關(guān)信號(hào)通路中作用的深入研究，為尋找新的、更好的治療方法和靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

miRNAs是一類長約22個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA分子，主要通過與蛋白質(zhì)編碼基因的信使RNA(message RNA，mRNA)配對(duì)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[3-5]。miRNA不僅是參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長、發(fā)育、分化的關(guān)鍵基因，同時(shí)還與人類疾病，特別是癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。miR-7作為miRNA家族中的一員，不僅參與機(jī)體正常組織器官的發(fā)育，同時(shí)還可作為抑癌基因，其表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]?，F(xiàn)就miR-7在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及信號(hào)通路等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miR-7的簡(jiǎn)介

miR-7成熟體由23個(gè)核苷酸組成[9-10]，其在正常腦組織、胰腺β細(xì)胞、心臟組織、皮膚的發(fā)育過程及腫瘤中均具有重要作用[11]。miR-7 有miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3三種亞型，分別位于基因組的不同位置，但最后的成熟序列均具有相同的生物學(xué)活性[12]。miR-7-1位于第9號(hào)染色體HNRNPK基因的內(nèi)含子中，miR-7-2位于第15號(hào)染色體的基因間區(qū)，miR-7-3位于第19號(hào)染色體PGSF1a的內(nèi)含子中[13]。每個(gè)miR-7基因都會(huì)產(chǎn)生3個(gè)獨(dú)特的初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別是pri-miR-7-1、pri-miR-7-2和 pri-miR-7-3。這些初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通常長度大于1 000 nt，并且包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)。RNA內(nèi)切酶Drosha將這些初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物裂解，生成前體miRNAs，稱為pre-miR-7-1、pre-miR-7-2和pre-miR-7-3，其長度約為110 nt，然后被Dicer轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中去除末端環(huán)路，形成一個(gè)短的由miR-7-5p和miR-7-3p鏈組成的雙工成熟miRNA。迄今為止，大部分研究集中在miR-7-5p上，通常簡(jiǎn)稱為miR-7[14]。

miR-7的調(diào)控主要分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。成熟miR-7表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平以及miRNA成熟過程的各個(gè)階段。在轉(zhuǎn)錄水平上，miR-7的表達(dá)受多種信號(hào)的影響；在轉(zhuǎn)錄后水平，miR-7通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)。這些相互作用可能會(huì)抑制目標(biāo)mRNA的翻譯和(或)降解[15]。

2 miR-7在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和功能

目前研究認(rèn)為，miR-7在結(jié)直腸癌中的表達(dá)是下調(diào)的。Wang等[16]采用微陣列平臺(tái)在結(jié)直腸癌組織中識(shí)別出8個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中miR-7的表達(dá)水平明顯降低。此外還發(fā)現(xiàn)，miR-7在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的表達(dá)也存在差異，可作為鑒別結(jié)直腸良惡性病變的指標(biāo)之一[16]。Xu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞相比，miR-7在多個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW620、SW480、LoVo、RKO、 LS174T)中的表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，除腫瘤組織中miR-7的表達(dá)顯著下降外，癌旁組織中miR-7的表達(dá)也明顯下降[17]。Zeng等[18]的研究證實(shí)，miR-7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常結(jié)腸組織，此外，miR-7的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期也相關(guān)。

miR-7在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)miR-7高表達(dá)時(shí)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，大部分結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞被阻滯在G1期，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[19]。Zeng等[18]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-7的表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的增殖和遷移；反之，下調(diào)miR-7的表達(dá)可增強(qiáng)HCT-8和Caco-2細(xì)胞系的增殖和遷移。以上研究表明，miR-7是一種腫瘤抑制因子，在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

3 miR-7抑瘤作用中的相關(guān)因子

在結(jié)直腸癌信號(hào)通路中，miR-7可與多個(gè)因子發(fā)生作用，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.1miR-7與Yin Yang 1 (YY1) YY1是GLIO-Kruppel家族中一種保守的多功能蛋白，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過調(diào)控不同基因的表達(dá)，參與胚胎形成、細(xì)胞增殖、凋亡、DNA修復(fù)和分化等多種生物學(xué)過程[20]。據(jù)報(bào)道，YY1在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤中均異常表達(dá)[21]。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中YY1的上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以及生存期呈正相關(guān)。YY1可通過調(diào)控p53、Wnt等重要信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮致癌作用[22]。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用silico搜索發(fā)現(xiàn)，YY1 mRNA 3′ UTR序列含有一個(gè)進(jìn)化保守的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，使用熒光素酶報(bào)告分析和Western blot分析證實(shí)，miR-7 直接結(jié)合于YY1 3′ UTR，負(fù)向調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞YY1蛋白的表達(dá)[22]。該研究表明，miR-7可通過調(diào)控下游靶位點(diǎn)YY1，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞中p53和Wnt依賴的信號(hào)通路，以抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展。

3.2miR-7與Paired box 6 (PAX6) PAX6是murine multigene家族成員之一，是一種涉及胚胎發(fā)育的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子[23]，在多個(gè)系統(tǒng)和器官的發(fā)育和功能中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)[24]、眼[25]、內(nèi)分泌腺[26]，胰腺[27]等。研究表明，PAX6在惡性腫瘤如膠質(zhì)瘤[28]、乳腺癌[29]、前列腺癌[30]等中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織相比，結(jié)直腸癌中PAX6基因外顯子5的甲基化頻率較高，證明PAX6在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮作用[31]。Li等[19]發(fā)現(xiàn)，PAX6 mRNA 3′ UTR序列中存在miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，并且PAX6是miR-7的直接靶基因。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)miR-7在Caco-2和SW480細(xì)胞系過表達(dá)時(shí)，腫瘤細(xì)胞大部分被阻滯在G1期；相反，PAX6過表達(dá)的Caco-2和SW480細(xì)胞系在G1和G2期的百分比最低，在S期的百分比最高，說明細(xì)胞處于快速分裂狀態(tài)[19]。以上研究表明，miR-7負(fù)調(diào)控PAX6，通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。進(jìn)一步研究miR-7和PAX6對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)信號(hào)通路的影響發(fā)現(xiàn)，miR-7和PAX6是通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B[phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB(Akt)]信號(hào)通路和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2及MMP-9蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用的，miR-7通過抑制PAX6的表達(dá)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，使MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)降低，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。

3.3miR-7與TYRO3 TYRO3是TAM家族(由酪氨酸激酶TYRO3、AXL以及MERTK組成)的成員，已被證實(shí)在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展和靶向治療耐藥性相關(guān)[32]。Qin和Qian[33]利用TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測(cè)miR-7的潛在靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，TYRO3是miR-7的靶基因。為進(jìn)一步證實(shí)TYRO3是否為miR-7的直接靶基因，將TYRO3 3′UTR野生型和突變型與miR-7類似物或miR-7陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-7降低了TYRO3 3′UTR野生型的相對(duì)熒光素酶活性，而在突變結(jié)合位點(diǎn)中熒光素酶活性未受影響[33]。采用Western blot檢測(cè)miR-7類似物轉(zhuǎn)染對(duì)LoVo、SW480和SW620細(xì)胞中TYRO3表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，miR-7過表達(dá)導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞中TYRO3的表達(dá)顯著下降，此外還發(fā)現(xiàn)miR-7的抑制能明顯增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系中PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路的活性，而這種作用可被TYRO3小干擾RNA抑制[33]。由此推斷，miR-7可通過調(diào)控TYRO3的表達(dá)，影響下游PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

3.4miR-7與X線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因2(X-ray repair cross-complementing gene 2,XRCC2) XRCC2位于染色體7q36.1，屬于rad51相關(guān)蛋白家族成員之一，參與同源染色體重組以維持染色體的穩(wěn)定性以及修復(fù)DNA損傷。研究表明，XRCC2與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)[34]。Curtin等[35]發(fā)現(xiàn)，XRCC2單核苷酸多態(tài)性可增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Xu等[17]首先發(fā)現(xiàn)，miR-7在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織標(biāo)本中的表達(dá)下調(diào)，四氮唑鹽比色法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-7過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步確定miR-7的作用機(jī)制，采用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-7可作用于XRCC2的3′UTR，熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)XRCC2是miR-7的直接靶基因[17]。因此，miR-7可通過靶向XRCC2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.5miR-7與黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK) FAK主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，引起細(xì)胞骨架蛋白的積累和解聚，通過影響細(xì)胞黏附站點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和膜突起調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)，同時(shí)促進(jìn)MMPs分泌，破壞細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，加速結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)侵襲能力[36]。研究證實(shí)，F(xiàn)AK與乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等相關(guān)，與腫瘤的增殖、凋亡、黏附以及遷移顯著相關(guān)[37]。Wu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-7通過與FAK mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合，抑制FAK的表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。據(jù)此，Zeng等[18]推測(cè)，miR-7也可通過調(diào)控FAK的表達(dá)在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該推測(cè)，在結(jié)直腸癌中，miR-7的過表達(dá)能顯著降低FAK蛋白的表達(dá)；相反，miR-7表達(dá)減少可導(dǎo)致FAK蛋白表達(dá)增加[18]。因此，miR-7通過靶向FAK蛋白的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

3.6miR-7與小腦變性相關(guān)蛋白 1 反義轉(zhuǎn)錄物(cerebellal degeneration-related protein 1 antisense,CDR1as) 環(huán)狀RNA是存在于真核細(xì)胞中的一種非線性RNA，具有穩(wěn)定性、特異性以及進(jìn)化保護(hù)性等特性。研究表明，環(huán)狀RNA能夠作為miRNA海綿發(fā)揮作用，其中CDR1as是miR-7的強(qiáng)海綿，在結(jié)直腸腫瘤中發(fā)揮重要作用[39]。Tang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，CDR1as下調(diào)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌HCT-116和DLD-1細(xì)胞系中，下調(diào)CDR1as的表達(dá)后，miR-7的表達(dá)顯著升高，且miR-7表達(dá)的升高導(dǎo)致HCT-116和DLD-1細(xì)胞的活力顯著下降。為了進(jìn)一步確定CDR1as表達(dá)的降低是否依賴于miR-7發(fā)揮作用，將miR-7抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CDR1as下調(diào)的HCT-116和DLD-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-7抑制劑顯著提高了腫瘤細(xì)胞的活力和侵襲能力。這些結(jié)果表明在結(jié)直腸癌中CDR1as與miR-7密切相關(guān)。

3.7miR-7與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin-release hormone,CRH)2/urocortin(Ucn)2 CRH是一個(gè)含有41個(gè)氨基酸的多肽，是應(yīng)激時(shí)對(duì)內(nèi)部和外部因素反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。CRH相關(guān)肽主要成員有CRH、Ucn、Ucn2、Ucn3，主要通過與CRH受體1 (CRH receptor 1，CRHR1)和CRHR2相結(jié)合，刺激垂體前葉釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，從而發(fā)揮生理功能[41]。研究表明，CRH相關(guān)肽及其受體也存在于腫瘤組織，通過自分泌和旁分泌的形式影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但具體的分子機(jī)制還不完全明確。Rodriguez等[42]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中CRHR2呈低表達(dá)，CRHR2表達(dá)減少促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤預(yù)后差和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步了解CRHR2/Ucn2信號(hào)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，Pothoulakis等[43]對(duì)5對(duì)野生型和過表達(dá)CRHR2的結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HT29,HCT116,SW620,SW480和DLD1)進(jìn)行高通量miRNA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有過表達(dá)CRHR2的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，miR-7的表達(dá)增加了2倍以上，表明miR-7可能是一個(gè)潛在的CRHR2/Ucn2信號(hào)靶點(diǎn)，隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)CRHR2/Ucn2信號(hào)能夠通過miR-7/YY1/Fas通路抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.8miR-7與長鏈非編碼RNA (long noncoding RNAs，lncRNAs) lncRNAs的長度大于200個(gè)核苷酸，是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能但缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的新型基因。lncRNAs屬于調(diào)節(jié)性非編碼RNA，在細(xì)胞的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，包括X染色體失活、剪接、印跡、表觀遺傳控制以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[44]。lncRNAs表達(dá)的失調(diào)存在于各種人類疾病中，尤其是乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等[45]。有證據(jù)表明，lncRNAs參與人類結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展，并可能作為新的治療靶點(diǎn)[46]。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可以充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，與miRNA競(jìng)爭(zhēng)下游靶基因的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制miRNA的功能[46-47]。Liu等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中l(wèi)ncRNAs可以發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA的作用與miR-7競(jìng)爭(zhēng)，影響其下游的靶基因SH3GLB1的表達(dá)和PI3K/Akt信號(hào)通路，從而發(fā)揮重要的作用。

4 小 結(jié)

越來越多的證據(jù)表明，miR-7是結(jié)直腸癌的一個(gè)重要抑制因子，其表達(dá)水平降低是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要因素。因此，miR-7在結(jié)直腸癌診治中具有良好的應(yīng)用前景。miR-7可作為一種潛在的結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物[49]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清中miR-7水平明顯低于健康對(duì)照組，隨后學(xué)者基于training cohort建立Logistic回歸模型，利用validation dataset進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，miR-7在區(qū)分結(jié)直腸癌患者和健康人方面具有很高的準(zhǔn)確性(training cohort和validation dataset上的曲線下面積分別為0.866和0.897)。此外，Ahmed等[50]通過檢測(cè)結(jié)直腸癌患者和健康人糞便中miR-7的水平發(fā)現(xiàn)，miR-7在糞便中的表達(dá)水平也存在明顯差異，提示通過檢測(cè)糞便中miR-7的水平可輔助診斷結(jié)直腸癌。因此，有學(xué)者開始研究miR-7作為腫瘤診斷依據(jù)的可行性。

miR-7可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種腫瘤的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其過表達(dá)可通過多種途徑抑制腫瘤的生長和侵襲。因此，有學(xué)者開始研究miR-7作為腫瘤治療新靶點(diǎn)的可行性。Tazawa等[51]構(gòu)建了高表達(dá)miR-7的溶瘤腺病毒治療腫瘤，該病毒高表達(dá)的miR-7通過影響多種轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，從而導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上研究提示，miR-7可作為治療結(jié)直腸腫瘤的新靶點(diǎn)。相信隨著人們對(duì)miR-7認(rèn)識(shí)的不斷加深，其有望為研究直結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及臨床診治提供一條新思路。