新型肝癌生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

梁靖晨，劉軍杰

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院超聲科，南寧530021)

我國肝癌的年病死率居腫瘤總病死率的第二位，其發(fā)病隱匿，進(jìn)展較快，確診時(shí)多已處于晚期，因此早期診斷對于改善患者的預(yù)后十分重要[1]。目前，早期的臨床篩查方法主要是血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)檢測和肝臟超聲檢查[2]。但AFP檢測的靈敏度和特異度有限，而超聲檢查很大程度上依賴操作者的主觀判斷，且常規(guī)超聲難以對肝臟占位性病變進(jìn)行有效鑒別。因此，迫切需要尋找更有效、更準(zhǔn)確的肝癌篩選方法。隨著對腫瘤生物學(xué)認(rèn)識(shí)的加深，液體活檢在提高肝癌的早期發(fā)現(xiàn)、改善患者預(yù)后、提高生存率及生存質(zhì)量等方面具有重要意義。為解決目前肝癌篩查和管理面臨的挑戰(zhàn)，有研究已經(jīng)識(shí)別并評估了肝癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，越來越多具有高敏感性和特異性的肝癌生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)并常規(guī)應(yīng)用于臨床檢測，如甲胎蛋白異質(zhì)體3(alpha-fetoprotein isoforms 3,AFP-L3)、熱激蛋白90α(heat shock protein 90α，Hsp90α)及高爾基體蛋白73(golgi protein 73，GP73)等[3]。現(xiàn)就近年來肝癌生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展予以綜述。

1 基于蛋白組的肝癌生物標(biāo)志物

1.1 與AFP功能互補(bǔ)的肝癌診斷標(biāo)志物

1.1.1 AFP-L3及GP73 AFP-L3由惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，是目前公認(rèn)的預(yù)測肝癌的有效指標(biāo)。美國食品藥品管理局于2005年批準(zhǔn)使用AFP-L3診斷肝癌，將診斷閾值界定為10%，即血清中的AFP-L3與AFP比率達(dá)到10%時(shí)，即使AFP的含量很低，也提示肝癌的高發(fā)生率,且不受影像學(xué)診斷陰性的影響[4]。研究表明，AFP-L3對肝癌的診斷具有極高的特異度(94%)，能夠有效減少假陽性[5]。目前AFP-L3與AFP、脫-γ-羧基凝血酶原均被列入國家“十三五”傳染病防治規(guī)劃，將是未來國內(nèi)外常用的肝癌診斷模式。

GP73屬于Ⅱ型高爾基體跨膜蛋白，是用于診斷原發(fā)性肝癌的潛在新型標(biāo)志物。Kladney等[6]指出GP73主要表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞，在肝細(xì)胞內(nèi)少見。李慶芝[7]分析研究了312例受試者血清中GPC3和AFP的表達(dá)差異，結(jié)果顯示GP73診斷肝癌的靈敏度、特異度、陽性率分別為88.6%、92.1%和90.6%,而AFP分別為65.3%、71.2%、60.6%，且GPC3對AFP陰性患者也有很好的診斷價(jià)值，具有一定的單獨(dú)診斷肝癌的能力。

目前臨床上常將AFP-L3與GP73聯(lián)合進(jìn)行檢測，有研究表明AFP-L3與GP73及AFP聯(lián)合診斷肝癌的靈敏度、特異度分別為95.1%、91.6%，聯(lián)合檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度和陰性預(yù)測值均高于GP73、AFP和AFP-L3單項(xiàng)檢測,但聯(lián)合檢測的特異度和陽性預(yù)測值與單項(xiàng)檢測比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8-9]。張平武和方林[10]研究發(fā)現(xiàn)GP73聯(lián)合及AFP-L3對于低濃度AFP肝癌患者的檢測具有更高的特異度、靈敏度及準(zhǔn)確度，分別為96.3%、94.4%及98.2%?？梢?，AFP-L3聯(lián)合GP73檢測在診斷肝癌方面具有很高的可行性。

1.1.2 Hsp90α Hsp90α是一種分子伴侶蛋白，能與腫瘤組織中的癌基因相結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移。Sun等[11]使用差異蛋白質(zhì)組學(xué)及酶聯(lián)免疫吸附測定法分析證實(shí)Hsp90α在20例HCC患者血清中的含量增高，提示Hsp90α對肝癌的早期診斷和預(yù)后具有一定的意義。Fu等[12]對1 647名受試者的血清樣本進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)Hsp90α診斷肝癌的靈敏度為92.7%，特異度為91.3%；診斷AFP陰性肝癌患者的靈敏度為93.9%,特異度為91.3%；同時(shí)，對于早期肝癌及小肝癌(≤3 cm)也有一定的診斷能力?？梢姡琀sp90α是一種非常有效的肝癌生物標(biāo)志物。目前Hsp90α檢測試劑盒已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)初步應(yīng)用于臨床，對于早期監(jiān)測腫瘤的發(fā)生、提高患者預(yù)后具有重要意義。

1.1.3 中期因子 中期因子是一種肝素結(jié)合細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞正常凋亡、促進(jìn)遷移等作用[13]。中期因子在大多數(shù)惡性腫瘤中均呈過表達(dá)。郭磊等[14]對501例包含肝癌在內(nèi)的受試者的血清樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示中期因子在癌組織中呈高表達(dá)；當(dāng)中期因子的診斷閾值設(shè)定為0.752 ng/mL時(shí)，其特異度與AFP相似(81.1%比76.7%)，但靈敏度顯著高于AFP(83.3%比51.2%),并且對AFP陰性的病例也有很好的診斷價(jià)值。劉晶華等[15]通過對50例肝癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)沉默肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)中期因子表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長和侵襲。由此可以推測中期因子是一種重要的癌蛋白，與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

1.2 與肝癌預(yù)后相關(guān)的蛋白類標(biāo)志物

1.2.1 骨橋蛋白與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 骨橋蛋白是一種分泌型磷酸化蛋白質(zhì)，在各種惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)。許多研究表明骨橋蛋白可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16-18]。郜玉峰等[16]發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白聯(lián)合細(xì)胞黏附因子CD44的變異體v6的檢測可能有助于預(yù)測肝癌的早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。張烜等[17]報(bào)道骨橋蛋白可以增強(qiáng)鈣蛋白酶小亞基1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。許英藝等[18]通過Meta分析得出骨橋蛋白的表達(dá)與腫瘤包膜的完整性有關(guān)的結(jié)論，推測骨橋蛋白在肝癌的肝內(nèi)浸潤及肝外轉(zhuǎn)移起重要作用?？梢?，骨橋蛋白在肝癌患者預(yù)后的判斷上具有重要參考價(jià)值。然而目前其促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全明確，并且針對肝癌骨橋蛋白靶向藥物的開發(fā)研究較少，這應(yīng)為未來的重點(diǎn)研究方向。

VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化并增強(qiáng)血管通透性的作用。Poon等[19]研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中的VEGF達(dá)到245 ng/L時(shí)，說明患者預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高。有研究探討聯(lián)合檢測VEGF與骨橋蛋白在預(yù)測肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及生存中的臨床價(jià)值，發(fā)現(xiàn)VEGF和骨橋蛋白單獨(dú)檢測時(shí)在相應(yīng)的高表達(dá)組和低表達(dá)組2年復(fù)發(fā)率分別為83.3%、76.2%和38.9%、39.4%，而聯(lián)合檢測預(yù)期高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者2年生存率和復(fù)發(fā)率分別為36.4%、78.9%和81.8%、26.3%，表明骨橋蛋白和VEGF可作為預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在參考分子指標(biāo)[20]。

1.2.2 Dickkopf-1(DKK-1) DKK-1是一種分泌型糖蛋白，在Wnt-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起拮抗作用，是目前最值得期待的肝癌診斷標(biāo)志物之一。Kim等[21]研究表明肝癌患者的DKK-1水平明顯高于對照組(中位數(shù)1.48 ng/mL比0.90 ng/mL，P<0.001),其診斷肝癌的靈敏度、特異度分別為90.7%和62.0%，將其與脫-γ-羧基凝血酶原和AFP聯(lián)合檢測時(shí)的AUC明顯高于單個(gè)標(biāo)記，且DKK-1過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，有助于評估患者預(yù)后。然而DKK-1作為肝癌生物標(biāo)志物還有很多不足，如診斷特異性差、檢測試劑盒價(jià)格昂貴等，因此仍需大量的研究探索DKK-1的價(jià)值及推進(jìn)臨床應(yīng)用。

1.2.3 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) TGF-β是一種具有多種生物學(xué)功能的超家族，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和腫瘤微環(huán)境促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。TGF-β1是TGF-β在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種分型，在肝癌患者血清中的含量遠(yuǎn)高于正常成年人和其他肝病患者[22]。萬裴琦等[23]研究了TGF-β1基因多態(tài)性與肝癌家族聚集的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攜帶TGF-β1-B位點(diǎn)C/C基因型和(或)TGF-β1-肝癌家族成員的C位G/A基因型基因具有更大的患肝癌風(fēng)險(xiǎn)?？梢姡琓GF-β1對肝癌的預(yù)測有重要意義。此外，還有研究表明TGF-β1可以抑制肝癌腫瘤干細(xì)胞的增殖，研究開發(fā)有效的 與TGF-β1信號通路相關(guān)的抑制劑有望成為治療肝癌的新策略[24]。

1.2.4 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3，GPC3) GPC3是一種硫酸乙酰肝素糖蛋白，在調(diào)控細(xì)胞生長、分化和遷移過程中起重要作用。研究顯示，血清中高濃度GPC3對肝癌患者的檢測靈敏度為75.0%，特異度為80.8%，作為肝癌診斷標(biāo)志物具有潛在的價(jià)值。此外，GPC3對于腫瘤靶向免疫治療也有一定意義[25]。人源化抗GPC3單克隆抗體作為單一藥劑已通過Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段，且無劑量限制性毒性。然而，Yen等[26]將185例肝癌晚期患者分為試驗(yàn)組和對照組，其中試驗(yàn)組接受1 600 mg/2周的人源化抗GPC3單克隆抗體靜脈注射治療，結(jié)果顯示試驗(yàn)組的中位無進(jìn)展生存期為2.6個(gè)月，對照組為1.5個(gè)月(P=0.87)，表明人源化抗GPC3單克隆抗體對肝癌并無顯著療效，其價(jià)值還需進(jìn)一步研究。Gao等[27]將兩種針對GPC3的抗體HN3和YP7融合到一段38 kDa的假單胞菌外毒素(PE38)中以產(chǎn)生免疫毒素，評估HN3-PE38和YP7-PE38的細(xì)胞毒性，并使用WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測了在一組細(xì)胞系上抑制細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果顯示HN3-PE38和YP7-PE38對GPC3陽性細(xì)胞系均有高特異性的細(xì)胞毒性作用，而對GPC3陰性細(xì)胞系則無明顯影響，且HN3-PE38比YP7-PE38更有效?？梢?，GPC3有望成為肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)，然而其分子特性及在肝癌中的作用機(jī)制尚未確定，仍有待進(jìn)一步的拓展。

2 基于轉(zhuǎn)錄組的肝癌診斷生物標(biāo)志物

2.1 AFP信使RNA(messenger RNA，mRNA) AFP mRNA從肝癌病變處分離入血并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,通過檢測血清AFP mRNA可以起到早期診斷肝癌、判斷預(yù)后的作用。邱大鵬等[28]聯(lián)合檢測AFP mRNA和AFP-L3在肝癌患者中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AFP mRNA和AFP-L3表達(dá)量明顯高于肝硬化組和其他肝病組，對肝癌的鑒別診斷具有一定意義。同時(shí)AFP mRNA對于肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移也有監(jiān)測作用。劉揚(yáng)等[29]對62例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行隨訪比對發(fā)現(xiàn)術(shù)前AFP mRNA陽性患者術(shù)后1、2、3年腫瘤復(fù)發(fā)率(58.3%、75.0%、100.0%)明顯高于AFP mRNA陰性患者(23.6%、42.1%、68.4%)，且AFP mRNA陽性患者較易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，今后的研究應(yīng)將如何消除術(shù)前血液中循環(huán)性肝癌細(xì)胞 (AFP mRNA陽性)作為重點(diǎn)，以達(dá)到阻斷腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的目的。

2.2 微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是在動(dòng)物、植物以及一些病毒中發(fā)現(xiàn)的約22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA分子，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA在腫瘤發(fā)生中起重要調(diào)節(jié)作用，一些miRNA在肝癌中上調(diào)起原癌基因的作用,如miR-17-5p、miR21、miR-210、miR-221、miR-222、miR-224；還有一些起抑癌基因的作用，如miR-122、miR-192、miR-199、miR-101、let-7家族、miR-99a，包括肝癌患者血清中降低的如miR-16、let-7f、miR-21、miR-139、miR-101、miR-122、miR-1[30-31]。在miRNA與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的探究也取得了一些成果，如miR-221和miR-222能誘導(dǎo)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抵抗從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力；miR-26a通過下調(diào)癌基因c-Myc、周期素依賴性激酶8和p21-活化激酶2來抑制異種移植肝癌的發(fā)展和原位肝癌的轉(zhuǎn)移，是抑制c-Myc/組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶雙高級肝細(xì)胞癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子[32]。此外，還有研究表明miR-139-5p及其同型均有抑制肝癌的作用，且異構(gòu)體的種類和數(shù)量越多，腫瘤的惡性程度越低[33]。Liang等[34]發(fā)現(xiàn)miR-106b在肝癌腫瘤組織中顯著增加，并與靶向Zbtb7a基因有因果關(guān)系，miR-106b敲除能顯著抑制Hub-7肝癌細(xì)胞的生長并增加細(xì)胞凋亡，提示miR-106b可作為肝癌的潛在治療策略。綜上可知，miRNAs對于肝癌的診斷和治療具有重要價(jià)值，是近年來實(shí)驗(yàn)室的研究熱點(diǎn)。然而miRNA的自身表達(dá)、相互作用以及與靶基因的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前仍不清晰，是未來需要研究的關(guān)鍵問題之一；如何通過已發(fā)現(xiàn)的miRNA抑癌作用進(jìn)行腫瘤的靶向治愈也是需要攻克的重要難題。

2.3 環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA) circRNA是一種新型的內(nèi)源性非編碼RNA，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和較高的組織特異性表達(dá)[35]。研究表明，異常的circRNA表達(dá)在肝癌的發(fā)生與進(jìn)展中起重要作用。Shang等[36]通過對circRNA表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005075可參與肝癌發(fā)展過程中的細(xì)胞黏附，可作為肝癌的潛在標(biāo)志物。林夏等[37]報(bào)道hsa_circ_0000711在肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721中明顯高表達(dá)，可能通過調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡影響肝癌細(xì)胞的增殖。Fu等[38]采用circRNA微陣列檢測肝癌細(xì)胞的整體circRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004018在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且hsa_circ_0004018可能通過與miRNAs的相互作用參與癌癥相關(guān)的途徑。Ren等[39]檢測到了127個(gè)差異表達(dá)的circRNA和3 235個(gè)差異表達(dá)的mRNA，選擇前5個(gè)上調(diào)的circRNA構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)它們參與p53、血管生成和細(xì)胞周期等與癌癥相關(guān)的信號通路；通過受試者工作特征曲線分析顯示circZFR、circFUT8、circIPO11可以顯著區(qū)分癌癥樣本，表明circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)有助于了解肝癌腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制。目前circRNA在肝癌中的作用機(jī)制尚不清楚，隨著circRNA提取、檢測技術(shù)的成熟，其有望成為早期診斷肝癌的標(biāo)志和治療的新靶標(biāo)。

3 其 他

3.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs) CTCs是指由癌組織脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞。已有研究表明，CTCs在肝癌早期即可進(jìn)入血液循環(huán)，分散于患者的體內(nèi)，當(dāng)受到一定的因素刺激時(shí)，它們會(huì)被喚醒并增殖擴(kuò)散到身體的其他部位或組織，引起肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，是預(yù)測肝癌患者預(yù)后的可靠生物指標(biāo)。對此，Sun等[40]對123例肝癌患者的血清進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CTCs能準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的分型及侵襲性，對肝癌的手術(shù)和術(shù)后治療具有指導(dǎo)意義。曹宇勃和許崇安[41]對1 133例肝細(xì)胞癌患者的血清進(jìn)行了薈萃分析，指出CTC陽性肝癌患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期比CTC陰性患者差,進(jìn)一步證實(shí)了測量外周血中CTCs對判斷肝癌的臨床預(yù)后具有重要意義。Ou等[42]發(fā)現(xiàn)CTCs表型可作為肝癌患者的預(yù)后指標(biāo)，通過用上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記CTCs異質(zhì)性發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)CTCs與高AFP水平、多瘤、栓子或小栓子的存在、早期復(fù)發(fā)有顯著相關(guān)性，其次是混合表型CTCs、上皮CTCs。因此，監(jiān)測體內(nèi)CTCs對腫瘤的早期診斷、治療、預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高患者預(yù)后等均具有指導(dǎo)意義。

3.2 循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)甲基化 ctDNA是一種存在于血液、腦脊液等體液中的細(xì)胞外DNA，主要來自壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞外泌體及CTCs[43]。DNA甲基化是DNA的共價(jià)修飾，在維持細(xì)胞正常功能、胚胎發(fā)育及遺傳過程中均發(fā)揮重要作用，異常的DNA甲基化是導(dǎo)致許多疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)[44]。近年來研究表明ctDNA甲基化在篩查、診斷及治療癌癥中的作用均具有很大優(yōu)勢。Xu等[45]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA甲基化標(biāo)志物對肝癌診斷的靈敏度和特異度分別為85.7%和94.3%，漏診率較AFP降低50%以上，并且建立了肝癌綜合診斷模型cd-score，此模型與傳統(tǒng)的肝癌監(jiān)測方法相比具有如下優(yōu)勢：①對肝癌診斷具有較高的靈敏度和特異性，可以有效鑒別診斷肝癌與其他肝臟疾??；②具有實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測腫瘤分子變化的功能；③可以檢測到在影像學(xué)上不明顯或不確定的腫瘤；④微創(chuàng)且價(jià)廉，適用于臨床推廣。上述研究表明，ctDNA甲基化可作為評估肝癌的優(yōu)良生物標(biāo)志物，具有較為廣闊的臨床應(yīng)用前景。

4 結(jié) 語

基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物信息處理技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了新型生物標(biāo)志物的研發(fā)，并在近年來取得了很多重大突破。除深入探討AFP、脫-γ-羧基凝血酶原、α-L-巖藻糖苷酶等經(jīng)典標(biāo)志物，一些新型生物標(biāo)志物(包括miRNA、circRNA、DKK-1、Hsp90α、CTCs、SCCA、GPC3、骨橋蛋白等)也被進(jìn)一步了解。然而，理想的肝癌生物標(biāo)志物應(yīng)該為肝癌所特有，敏感性高，能在肝癌發(fā)生的早期被檢出，大多數(shù)現(xiàn)有的標(biāo)志物無法達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)。為了提高肝癌的早期診斷率，保障患者的生存質(zhì)量，很多學(xué)者使用不同的生物標(biāo)志物和AFP檢測相結(jié)合，有效降低了疾病的漏診率和誤診率?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，生物標(biāo)志物并不局限于肝癌的早期篩查和診斷，如AFP mRNA、骨橋蛋白、CTCs等在肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中也起重要作用，成為評估其預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。期望結(jié)合物理、化學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)等先進(jìn)技術(shù)，將研究成果轉(zhuǎn)化為臨床，從而為癌癥患者帶來益處。