蛋白C途徑的抗炎及其在自身免疫性疾病中的作用

袁葉雙，蔣 科，楊小紅,3※

(1.川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川 南充 637100；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院免疫室，四川 南充 637100)

蛋白C是一種絲氨酸蛋白酶酶原，其經(jīng)凝血酶作用形成活化蛋白C(activated protein C,aPC)，具有抗凝血、細(xì)胞保護(hù)、抗炎及抗凋亡等作用。臨床試驗(yàn)(PROWESS和PROWESS-SHOCK)顯示，重組人活化蛋白C在缺血性損傷時(shí)具有抗炎和保護(hù)神經(jīng)及腦血管內(nèi)皮的作用[1]。鑒于aPC明確的抗炎及抗凝血作用，美國(guó)食品藥品管理局曾批準(zhǔn)禮來(lái)公司的重組人活化蛋白C(商品名 Xigris)用于治療中毒膿血癥和膿血癥休克。然而，Cochrane系統(tǒng)評(píng)價(jià)提示Xigris可增加嚴(yán)重出血導(dǎo)致的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]，故禮來(lái)公司于2011年宣布Xigris退市。3K3A-APC是一種aPC的基因工程變構(gòu)體，有研究顯示，3K3A-APC的抗凝血能力較天然aPC降低90%左右，而在抗炎作用、神經(jīng)和血管保護(hù)作用等其他方面未發(fā)現(xiàn)明顯改變[3-6]。目前，3K3A-APC治療急性缺血性腦卒中的Ⅱa期臨床試驗(yàn)(RHAPSODY)已經(jīng)結(jié)束，初步結(jié)果顯示其可以有效降低顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)[7]。同時(shí)鑒于3K3A-APC的抗炎和血管保護(hù)作用，其還有可能成為新的治療炎性疾病(炎性腸病、哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)的方法?，F(xiàn)就蛋白C途徑的抗炎及其在自身免疫性疾病中的作用予以綜述。

1 蛋白C的結(jié)構(gòu)與功能

蛋白C是一種維生素K依賴的血清蛋白酶酶原，由肝臟產(chǎn)生，其在正常血漿中的濃度約為70×10-9mol/L，而其活化形式aPC只有40×10-12mol/L[8]。在健康人體內(nèi)，蛋白C的半衰期約為8 h，而aPC約為15 min[3]。蛋白C以單鏈形式存在于循環(huán)中，含419個(gè)氨基酸。當(dāng)?shù)鞍證與細(xì)胞膜上的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial protein C receptor,EPCR)結(jié)合后，其在第169位精氨酸處被凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物水解成兩條肽鏈(輕鏈和重鏈)，輕鏈第141位半胱氨酸和重鏈第277位半胱氨酸間形成二硫鍵連接后活化為aPC。依據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，aPC分為3個(gè)區(qū)域：①輕鏈N端的γ-羧基谷氨酸區(qū)域，這是與蛋白S和Ca2+結(jié)合的區(qū)域；② 2個(gè)表皮因子同源區(qū)域；③重鏈C端的絲氨酸蛋白酶區(qū)域，為活性區(qū)域[9]。

aPC在蛋白S和Ca2+的協(xié)助下使凝血因子Ⅴ在第306位精氨酸和第506位精氨酸處及凝血因子Ⅷa在第336位精氨酸或第562位精氨酸處水解，使凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷa不可逆的失活，從而抑制凝血途徑。與凝血因子Ⅷa不同，凝血因子Ⅴa需要同時(shí)對(duì)2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行剪切才能滅活，基因變異型凝血因子Ⅴa Leiden個(gè)體因第506位精氨酸被谷氨酰胺替代而不能被aPC滅活，所以常發(fā)生靜脈血栓[10]。有研究對(duì)aPC的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其一側(cè)包含3個(gè)外顯袢：39-loop、60-loop和70-80-loop，通過(guò)基因誘變使3個(gè)袢中的氨基酸突變，均可造成aPC的抗凝功能部分喪失，表明這3個(gè)袢是aPC發(fā)揮抗凝作用的活性部位[9，11]。而在aPC結(jié)構(gòu)的另一側(cè)，包含能與EPCR結(jié)合的位點(diǎn)，從而使aPC通過(guò)該受體發(fā)揮多種生理學(xué)作用，人們對(duì)其中的抗炎作用較為感興趣。

2 蛋白C系統(tǒng)

一般認(rèn)為，aPC與內(nèi)皮細(xì)胞表面EPCR結(jié)合后能產(chǎn)生多種不同的作用，其中主要有抗凝血作用和細(xì)胞保護(hù)作用。aPC的細(xì)胞保護(hù)作用包括抗凋亡和抗炎活性，以及穩(wěn)定內(nèi)皮屏障的能力。這些細(xì)胞保護(hù)作用通常需要EPCR，并涉及aPC激活G蛋白偶聯(lián)受體蛋白酶激活受體(protease-activated receptor,PAR)1的能力。PAR-1激活后可以調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，如通過(guò)核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的細(xì)胞表面黏附分子；還可以通過(guò)PAR-1在體外激活內(nèi)皮細(xì)胞中的促分裂原活化的蛋白激酶途徑[12]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)缺乏EPCR或PAR-1時(shí)，蛋白C途徑信號(hào)通路無(wú)法正常進(jìn)行[13]。此外，aPC還有其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些途徑可能需要PAR3、鞘氨醇-1-磷酸受體1、Mac-1、載脂蛋白E受體2、表皮生長(zhǎng)因子受體、tie2和(或)其他受體參與，其中有一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不需EPCR的參與[14-16]。

2.1EPCR EPCR是一種跨膜蛋白，其空間結(jié)構(gòu)與CD1d家族蛋白同源。EPCR的抗原呈遞區(qū)可以與磷脂結(jié)合，并導(dǎo)致蛋白C釋放。EPCR一般分布在一些器官的血管內(nèi)皮上，少量分布在微血管上，另外其在一些細(xì)胞膜上也有表達(dá)，如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元等[17]。關(guān)于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究顯示，EPCR主要與蛋白C的γ-羧基谷氨酸端ω-loop上的Phe-4和leu-8位點(diǎn)結(jié)合[18]。EPCR作為蛋白C信號(hào)通路的重要受體，其與aPC結(jié)合可以引起PAR-1激活，并引起后續(xù)一系列細(xì)胞保護(hù)作用[19]。且EPCR作為aPC激活PAR-1的共受體，可以介導(dǎo)aPC的細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)也可以作為PAR-1信號(hào)通路中的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑[20]。但aPC與EPCR結(jié)合無(wú)法直接傳遞信號(hào)，其在細(xì)胞膜表面的表達(dá)可以影響aPC的作用。

有證據(jù)顯示，EPCR表達(dá)減少是引起炎癥的原因之一[21]。在炎癥反應(yīng)中內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，膜表面的EPCR脫落到血漿或尿液中形成可溶性EPCR?？扇苄訣PCR對(duì)aPC的親和力不變，其能與aPC結(jié)合但無(wú)法進(jìn)一步傳導(dǎo)信號(hào)，因此可視為一種競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑[21]；同時(shí)，可溶性EPCR也可作為一種炎癥反應(yīng)生物標(biāo)志物在多種疾病中應(yīng)用，如敗血癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[22]。此外，可溶性EPCR可通過(guò)活化的中性粒細(xì)胞分泌蛋白和β2整合素Mac-1復(fù)合物與活化的中性粒細(xì)胞膜結(jié)合并被分解[23]。

2.2PAR-1 PAR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，其可以通過(guò)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、神經(jīng)元、免疫系統(tǒng)細(xì)胞和其他細(xì)胞直接環(huán)境中的特異性蛋白酶，并與之結(jié)合激活適當(dāng)?shù)募?xì)胞信號(hào)途徑。PAR-1為aPC細(xì)胞保護(hù)作用激活信號(hào)的主要受體，aPC激活PAR-1需要EPCR的介導(dǎo)[19,24]。最早發(fā)現(xiàn)的PAR-1經(jīng)典激活途徑由凝血酶激活[25]，并介導(dǎo)產(chǎn)生破壞性作用，且凝血酶對(duì)PAR-1的催化效率是aPC的3～4倍[26]。PAR-1被凝血酶和aPC激活可以引起互斥反應(yīng)。如aPC激活PAR-1后可以產(chǎn)生保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，防止血管滲漏，而凝血酶激活PAR-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用；另外，aPC的抗炎作用和凝血酶的促炎作用也都是通過(guò)激活PAR-1而產(chǎn)生[27]。

3 蛋白C途徑的抗炎作用

血管通透性升高、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)尤其是細(xì)胞因子的釋放是所有炎性疾病的病理基礎(chǔ)。研究顯示，aPC在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能、降低血管通透性、抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及調(diào)控細(xì)胞因子分泌等方面發(fā)揮重要作用[28-30]。

3.1降低血管通透性 炎癥部位血管通透性升高、血液成分外泄是造成炎癥部位腫脹的主要原因。研究顯示，炎癥部位的凝血酶活性和aPC水平升高，且aPC水平與炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)，而補(bǔ)充外源性重組人活化蛋白C可明顯降低血管的通透性，減輕炎癥反應(yīng)[28]。對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，aPC可以抑制NF-κB基因表達(dá)，減少黏附分子的表達(dá)；同時(shí)，aPC還可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性，抑制血管通透性升高[28]。

進(jìn)一步研究顯示，凝血酶通過(guò)作用于PAR-1 N端第41位精氨酸，使PAR-1與Gq和(或)G12/13蛋白偶聯(lián)，并激活致血管內(nèi)皮損傷、通透性升高的信號(hào)通路，而aPC與EPCR結(jié)合后作用于PAR-1 N端的精氨酸-46，與Gi/o蛋白偶聯(lián)，繼而激活鞘氨醇-1-磷酸受體1和tie2[29]。aPC激活PAR-1后，β-arrestin 2和dishevelled-2 聚合可以活化Rac-1并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整[29]。有研究表明，載脂蛋白E受體2可以與EPCR共同促進(jìn)細(xì)胞保護(hù)性PAR-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)蛋白激酶B或糖原合成酶激酶3β信號(hào)通路激活，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受凝血酶的破壞[30]。

3.2抑制炎癥細(xì)胞遷移/趨化 在炎癥細(xì)胞向炎癥部位的遷移過(guò)程中，細(xì)胞表面的整合素與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，使細(xì)胞向炎癥部位游走。而aPC能直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB的p50和p52亞基表達(dá)，使NF-κB與靶位點(diǎn)的結(jié)合功能降低。同時(shí)，aPC還能阻斷TNF-α誘導(dǎo)的下游NF-κB基因的表達(dá)，如細(xì)胞黏附因子和E-選擇素等，抑制炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮部位的黏附作用，抑制白細(xì)胞附壁，減少炎癥細(xì)胞因子滲出，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[28]。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列是一個(gè)可以與整合素結(jié)合的模體，其廣泛存在于多種細(xì)胞外基質(zhì)黏附蛋白中，如纖維粘連蛋白、纖維蛋白原和骨橋蛋白等。氨基酸序列分析顯示，在aPC重鏈C端的活性區(qū)域中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，可以與中性粒細(xì)胞表面的整合素β1和β3亞單位結(jié)合，改變整合素的分子構(gòu)象，使整合素?zé)o法與其他黏附蛋白結(jié)合；在體外實(shí)驗(yàn)中，aPC可以抑制中性粒細(xì)胞的黏附和遷移作用[31]。aPC與整合素結(jié)合不需要EPCR或PAR的參與，也沒(méi)有信號(hào)通路的參與。然而，野生型aPC的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列沒(méi)有完全暴露在外側(cè)，且aPC在血漿中的濃度很低(50 ng/mL)，故aPC在體內(nèi)抑制中性粒細(xì)胞黏附和遷移的作用并不明顯[31]。而通過(guò)調(diào)整aPC構(gòu)象、調(diào)節(jié)治療劑量或許可以增強(qiáng)此作用。

3.3調(diào)控致炎細(xì)胞因子的表達(dá) 參與炎癥的細(xì)胞因子從功能上可分為兩類：促炎癥細(xì)胞因子[TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1、IL-6等]和抗炎癥細(xì)胞因子(IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、IL-2等)。aPC可通過(guò)調(diào)節(jié)這兩類細(xì)胞因子達(dá)到抑制炎癥的目的。細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，加入aPC后，炎癥細(xì)胞因子IL-1β和γ干擾素的分泌減少，而IL-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1分泌增加[21]。另一項(xiàng)大鼠實(shí)驗(yàn)顯示，aPC治療后大鼠血清中的TNF-α和IL-6水平降低[32]。

aPC作用于單核細(xì)胞上的PAR-1，其可以促進(jìn)單核細(xì)胞中的p38促分裂原活化的蛋白激酶磷酸化，激活p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑，促使單核細(xì)胞產(chǎn)生并釋放IL-10[33]。IL-10可以抑制多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑制炎癥的目的。另一方面，aPC能通過(guò)調(diào)節(jié)Rel同源結(jié)構(gòu)域中p65/RelA在第276位絲氨酸及反式激活域第536位絲氨酸的磷酸化抑制NF-κB基因的表達(dá)[34]。此外，IL-1β、TNF-α、內(nèi)毒素以及促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路可以調(diào)控膜表面的EPCR脫落，形成可溶性EPCR，從而抑制aPC的功能[12]。

4 蛋白C途徑在自身免疫性疾病炎癥中的作用

蛋白C途徑已被證實(shí)參與了多種炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展，其在自身免疫性疾病的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)，如炎性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病及實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎等。同時(shí)，一些動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)aPC對(duì)一些炎性疾病癥狀的控制有較好作用[35-37]。

4.1炎性腸病 炎性腸病患者的凝血系統(tǒng)紊亂，患者處于凝血過(guò)快的血栓前狀態(tài)。臨床上，炎性腸病一般分為兩種：潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。有研究證實(shí)，潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患者的血清蛋白C、血栓調(diào)節(jié)蛋白及蛋白S增多，這表明蛋白C和aPC未能與腸黏膜微血管有效結(jié)合[38]。故蛋白C系統(tǒng)功能不足，可能是導(dǎo)致血栓前狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的原因之一[38]。同時(shí)，微血管血栓可以導(dǎo)致腸黏膜缺血，從而進(jìn)一步引起黏膜損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性炎性腸病患者結(jié)腸黏膜微血管和腸微血管內(nèi)皮中EPCR的表達(dá)減少，這可能由于炎癥細(xì)胞因子的增加所致[35]。另外，aPC功能降低引起的內(nèi)皮屏障穩(wěn)定作用減弱、白細(xì)胞聚集和炎癥因子滲出等因素均影響著炎性腸病的發(fā)展[35]。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UC小鼠模型的蛋白C途徑被抑制，且結(jié)腸炎癥程度與蛋白C活性呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能為由巨噬細(xì)胞分泌的促炎癥細(xì)胞因子影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，進(jìn)而抑制蛋白C途徑[35]。可見(jiàn)，蛋白C途徑或許可以成為炎性腸病發(fā)病機(jī)制及治療研究的新方向。

4.2類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性疾病，累及多個(gè)關(guān)節(jié)滑膜，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的TNF-α表達(dá)上調(diào)，NF-κB信號(hào)途徑激活是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展的重要機(jī)制之一。而aPC對(duì)TNF-α及NF-κB途徑有明顯的抑制作用。有研究顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中的aPC和基質(zhì)金屬蛋白酶2水平升高，且與健康人相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞中生成的MMP-9更多[32]?；|(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9通過(guò)促進(jìn)血管生成和直接降解軟骨基質(zhì)，在關(guān)節(jié)軟骨降解中起關(guān)鍵作用。因此，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中aPC可以抑制炎癥反應(yīng)，并間接調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨組織的重構(gòu)。

4.3糖尿病 1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，其能引起胰島β細(xì)胞的破壞，減少胰島素的生成。在非肥胖糖尿病小鼠模型中，aPC的應(yīng)用增加了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，抑制了T細(xì)胞的分化和炎癥細(xì)胞因子IL-1β及γ干擾素的產(chǎn)生，減輕了胰島的炎癥反應(yīng)，在1型糖尿病中起保護(hù)作用[36-37]。1型糖尿病可以導(dǎo)致腎臟損傷，最終可能達(dá)到終末期腎衰竭。而aPC在小鼠慢性腎損傷模型中有保護(hù)作用[39]。糖尿病相關(guān)的胰島素信號(hào)受損導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制，而aPC對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物和線粒體的影響，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能密切相關(guān)[40]。實(shí)驗(yàn)顯示，aPC可以通過(guò)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重編程補(bǔ)償胰島素信號(hào)的缺陷，從而減輕對(duì)腎臟的損傷[41]。

4.4實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎/多發(fā)硬化 多發(fā)性硬化是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。瑢?shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動(dòng)物模型是多發(fā)性硬化的模擬動(dòng)物模型。有學(xué)者對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動(dòng)物模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-10分泌的增加、脊髓白細(xì)胞浸潤(rùn)減少、小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少抑制了蛋白C和aPC，并導(dǎo)致血腦屏障的通透性升高[42]。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠模型中，aPC的應(yīng)用雖然可以調(diào)節(jié)疾病的嚴(yán)重程度，但對(duì)緩解率和病程無(wú)明顯影響[42]。其主要原因?yàn)閍PC抑制了脾臟和淋巴結(jié)中免疫細(xì)胞的增殖，減少了炎癥細(xì)胞因子IL-17、TNF-α等的分泌，從而減輕了炎癥細(xì)胞因子對(duì)中樞神經(jīng)的損傷。此外，aPC對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制也對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，aPC對(duì)中樞神經(jīng)線粒體功能和髓鞘形成有不可或缺的作用[43]。

5 小 結(jié)

aPC的抗凝血及抗炎作用在多種疾病中起保護(hù)作用，尤其是炎癥損傷性疾病。在多種動(dòng)物模型中，aPC的應(yīng)用對(duì)疾病的緩解有積極作用，且其安全性問(wèn)題已通過(guò)基因工程變構(gòu)體解決。因此，對(duì)aPC及其相關(guān)受體EPCR和PAR在各類疾病中的研究或許可以為一些疾病提供新的診斷及病程監(jiān)測(cè)指標(biāo)或治療方案。然而，還有一些問(wèn)題有待解決，如aPC調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制和aPC抵抗對(duì)疾病的影響等尚不明確，且新型變異體的有效性及安全性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。