H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表達及鑒定

余曉穎，田園，張國利，吳廣謀，劉雨玲，李澤鴻，岳玉環(huán)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬，是一類新近發(fā)現(xiàn)能感染犬的流感病毒。CIV在犬間傳播迅速，能引起患犬咳嗽、流涕和發(fā)熱等呼吸系統(tǒng)疾病[1]。甲型流感病毒又根據(jù)HA分為17種亞型，NA分為9種亞型，能組成153個血清型甲型流感病毒。流感病毒基因組約為13 kb，含有8個基因節(jié)段，分別編碼血凝素HA，神經(jīng)氨酸酶NA,M1基質(zhì)蛋白，M2離子通道蛋白，NP核蛋白，NS非結(jié)構(gòu)蛋白及RNA聚合酶復(fù)合體(PB1蛋白、PB2蛋白、PA蛋白)[2]。近十年來流感病毒感染犬類病例的相關(guān)報道迅速增多，這些病毒不僅威脅到了犬的健康，同樣也給公共安全帶來了威脅。2004年，美國佛羅里達某賽犬場的賽犬出現(xiàn)體溫升高、咳嗽、噴嚏為主的癥狀，最后因出血性肺炎死亡；2005年，美國加利福尼亞該病卷土重來，在加利福尼亞等11個州迅速蔓延，導(dǎo)致20個賽犬場大量賽犬發(fā)病，同時引起佛羅里達州的許多寵物犬感染；經(jīng)鑒別證實該病原為亞型H3N8流感病毒，具有馬流感病毒特征，并發(fā)生了變異。研究人員認為，該病最初的流行是犬與馬的密切接觸導(dǎo)致了病毒的傳入和感染，并把該病稱之為“犬流感”[3]。2006年，在中國南方出現(xiàn)了另一類犬流感，犬對H3N2亞型流感病毒的感染[4]。2007年，韓國報道了A型H3N2亞型流感病毒引起的犬呼吸道疾病。研究發(fā)現(xiàn)該病毒可以在犬之間進行直接傳播，同時也表明H3N2 亞型犬流感病毒已經(jīng)進入到韓國和我國的犬群中[5]。

M1和M2蛋白是基質(zhì)蛋白，是一種非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA節(jié)段、丙型流感病毒的6RNA節(jié)段編碼[6]。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的內(nèi)側(cè)，也稱為內(nèi)膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。M1由252個氨基酸殘基組成，分子量約28 kD,它是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，占流感病毒蛋白總量的40%。M1蛋白在病毒感染細胞的后期才被合成,能與病毒核糖核蛋白體(vRNPs)相互作用，抑制病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄,并協(xié)助vRNPs從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞漿[7]。M1蛋白與流感病毒復(fù)制有關(guān)，能與HA及NA蛋白相互作用，并參與病毒子粒的裝配及釋放[8]。

M1蛋白在流感病毒中高度保守，是病毒粒子中最豐富和最保守的蛋白質(zhì)，每個病毒粒子的分子數(shù)量至少是HA蛋白的兩倍，基于保守抗原制備的抗體可以為多種亞型流感提供廣譜保護[9]，為此本研究擬制備H3N2型犬流感病毒M1蛋白純品，為進一步制備通用型抗犬流感病毒抗體提供純品抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒基因、質(zhì)粒和菌種 H3N2犬流感病毒全基因組cDNA由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所生物技術(shù)應(yīng)用與基因工程藥物實驗室保存；pET-SUMO質(zhì)粒、大腸桿菌One Shot?Mach1TM-T1R感受態(tài)細胞和E.coliBL21(DE3)購于美國英杰生命技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 引物由長春庫美生物公司合成；Ex TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒、HRP標記的抗His標簽的鼠的單克隆抗體和HRP標記的羊抗屬IgG均購于北京康為世紀生物科技有限公司；卡納霉素及氨芐西林購于寶泰克生物技術(shù)有限公司；甘氨酸、丙烯酰胺、誘導(dǎo)劑IPTG及SDS購于Sigma公司；CuSO4化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純購于北京化工廠；SP-Sepharose Fast Flow 層析填料和Chelating Sepharose Fast Flow層析填料購于美國GE Healthcare。

1.1.3 實驗動物 昆明鼠，6周齡，平均體重21 g，雄性，購于長春生物制品研究所有限責(zé)任公司。

2 方 法

2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中H3N2犬流感病毒M1基因序列(JX414245.1)設(shè)計引物。上游引物P1：5'-ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3'；下游引物P2：5'-CCGGAATTCTTATCACTTAAATC￣GCTGCATCTGCACT-3'(下劃線部分為EcoR I酶切位點)。引物由長春庫美生物公司合成。

2.2 M1基因的擴增 以H3N2型犬流感病毒全基因組cDNA為模板，PCR擴增M1基因序列。預(yù)期擴增產(chǎn)物長771 bp。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察。切下特異性的片段，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

2.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的M1基因片段連接至pET-SUMO質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌One Shot?Mach1TM-T1R 感受態(tài)細胞，搖菌鑒定，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，然后進行PCR鑒定，正確的陽性質(zhì)粒命名為pET-SUMO-M1，并送長春庫美生物公司測序。利用DNAssist軟件分析測序結(jié)果。

2.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達及可溶性分析 將測序正確的pET-SUMO-M1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，以IPTG為誘導(dǎo)劑在37 ℃條件下進行誘導(dǎo)表達，另設(shè)立不加入IPTG作為對照，離心收集菌液，裂解液裂解，超聲處理，分離上清及沉淀，用15% SDS-PAGE凝膠電泳分析目的蛋白的表達情況。

2.5 表達產(chǎn)物的初步純化 菌體超聲后用10%硫酸銨沉淀和45%硫酸銨沉淀進行粗純。之后用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析柱進行初步純化。再用Western blot 鑒定初步純化的蛋白產(chǎn)物。

2.6 目的蛋白的精純 采用(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow 層析柱對SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析柱初步純化的樣品進一步的純化，然后用SUMO蛋白酶酶切純化產(chǎn)品，用SUMO蛋白酶酶切金屬螯和層析純化后的目的蛋白，酶切條件為30 ℃ 6 h。將融合蛋白中的SUMO蛋白與M1蛋白分開，再通過(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow層析柱去掉溶液中的SUMO蛋白成分。最后通過透析法以及蛋白濃縮法提高蛋白的濃度，并使目的蛋白處在1×PBS(pH7.2)緩沖液中保存。利用薄層掃描法分析純化后蛋白的純度以及使用BCA蛋白濃度試劑盒測得蛋白的濃度。

2.7 M1蛋白多抗的制備 因本實驗中純化出的目的蛋白始終為4條帶，為驗證這4條帶是否均為目的蛋白，特制備鼠抗M1蛋白多抗對其進行檢驗。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，將準確的相對分子質(zhì)量為28 kD的M1蛋白凝膠條帶取出，免疫小鼠，制備多抗。將M1蛋白純品與氫氧化鋁佐劑按9∶1混合，經(jīng)皮下注射昆明鼠，50 μg/只，首次免疫前通過尾部采血分離血清，間隔兩周免疫1次，共免疫3次，并在免疫后第14、21、28和42天尾部采血分離血清。根據(jù)間接ELISA法測抗體效價，以高于對照組平均值的兩倍以上的最終稀釋倍數(shù)為檢測樣品的效價。

2.8 目的蛋白的鑒定 取目的蛋白進行12% SDS-PAGE電泳分離，利用半干轉(zhuǎn)移法將目的蛋白和蛋白Marker轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；然后將PVDF膜浸泡在含3% Milk的PBS緩沖液中，在4 ℃條件下封閉10 h，用PBS洗滌3次；一抗用M1蛋白(28 kD)免疫小鼠制備的抗體(1∶1000稀釋)，37 ℃孵育2 h，用PBST洗滌3次，二抗用HRP標記的羊抗鼠抗體(1∶3000稀釋)孵育，37 ℃孵育2 h，用TBST洗滌3次，最后用DAB進行顯色并分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 M1基因的擴增 以H3N2犬流感病毒全基因組cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小為771 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

3.2 重組表達質(zhì)粒pET-SUMO-M1的構(gòu)建及PCR鑒定 通過1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，被插入的片段大小為771 bp，大小與預(yù)期相符(圖2)。重組質(zhì)粒pET-SUMO-M1測序結(jié)果用DNAssist軟件分析顯示，其插入外源序列與GenBank中H3N2犬流感病毒M1基因序列一致，M1目的基因片段以正確的方向插入到pET-SUMO質(zhì)粒中，重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M: DL2000 DNA Marker；1: M1基因PCR產(chǎn)物；2：陰性對照M: DL2000 DNA Marker；1: M1 gene PCR product；2：Negative control圖1 犬流感病毒M1蛋白基因擴增結(jié)果Fig 1 Canine influenza virus M1 protein gene amplification results

M: DL2000 DNA Marker；1:PET-SUMO-M1重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物M: DL2000 DNA Marker；1:PET-SUMO-M1 recombinant plasmid PCR product圖2 PET-SUMO-M1重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Fig 2 PCR identification results of PET-SUMO-M1 recombinant plasmid

3.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達及可溶性分析 表達的融合蛋白SUMO-M1經(jīng)15%SDS-PAGE分析，可清晰看到融合蛋白大量表達，相對分子質(zhì)量為41 kD(圖3)。工程菌超聲處理后，上清液和沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE分析，表達的融合蛋白主要在上清液中，因此融合蛋白以可溶形式表達(圖4)，薄層掃描顯示表達量占菌體總蛋白的25.6%。

M:蛋白質(zhì)Marker；1:誘導(dǎo)的工程菌；2:未誘導(dǎo)的工程菌M:Protein Marker；1:Induced engineering bacteria；2:Uninduced engineering bacteria圖3 工程菌誘導(dǎo)表達結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analysis of induced expression of engineering bacteria

M:蛋白質(zhì)Marker；1：超聲后上清液；2:超聲后沉淀M:Protein Marker；1：Supernatant after ultrasonic treatment；2:Post-ultrasonic precipitation圖4 工程菌超聲破碎后SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of engineering bacteria after ultrasonication

3.4 重組融合蛋白的純化和Western blot分析 誘導(dǎo)后的工程菌超聲處理，上清通過硫酸銨沉淀法粗純，重組融合蛋白主要在45%硫酸銨沉淀中，經(jīng)SP-Sepharose Fast Flow 陽離子交換層析柱，線性洗脫收集蛋白峰經(jīng)15% SDS-PAGE分析，重組融合蛋白主要在21%B～100%B洗脫樣品中，蛋白的相對分子質(zhì)量為41 kD，大小與預(yù)期相符(圖5)，但純化出的重組融合蛋白41 kD條帶下面緊連著3條大小不同的條帶，由于重組融合蛋白N端帶有6×His標簽，用Western blot分析鑒定顯示，純化的重組融合蛋白能夠被抗His標簽的鼠的單克隆抗體識別(圖6)，表明重組融合蛋白獲得正確表達，具有良好的免疫原性，且四條條帶均可發(fā)生免疫反應(yīng)。

3.5 目的蛋白的純化 取SP陽離子交換層析柱純化出的重組融合蛋白，經(jīng)(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow層析柱第二步精純除雜蛋白，15% SDS-PAGE分析顯示，重組融合蛋白在洗脫液B(40 mmol/LPB、0.3 mol/L NaCl、150 mmol/L咪唑，pH6.6)中(圖7)。重組融合蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后，通過第三步(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow層析柱純化，使目的蛋白和SUMO蛋白進行分離，經(jīng)12% SDS-PAGE分析(圖8)，目的蛋白都在流穿液中，成功達到分離目的，獲取高純度的目的蛋白，蛋白純度為94.6%，最終獲取的目的蛋白濃度為0.541 mg/mL。

1：45%硫酸銨沉淀；M:蛋白Marker；2：流穿；3：流穿；4：21%B～74%B洗脫峰；5：75%B～100%B洗脫峰；6: 0.5mol/L NaCl 洗脫峰；7：2mol/L NaCl洗脫峰；8：0.5 mol/L NaOH洗脫峰1：45% ammonium sulfate precipitation；M:Protein Marker；2：Flow through liquid；3：Flow through liquid；4：21% B～74% B eluting peak；5：75%B～100%B eluting peak；6: 0.5mol/L NaCl eluting peak；7：2mol/L NaCl eluting peak；8：0.5 mol/L NaOH eluting peak圖5 SP陽離子交換層析柱純化結(jié)果Fig 5 SP cation exchange chromatography column purification results

M:蛋白Marker；1：SP 21%B～74%B洗脫樣品；2：SP 75%B～100%B洗脫樣品；3：SP 21%B～74%B洗脫樣品免疫印跡；4：SP 75%B～100%B洗脫樣品免疫印跡M:Protein Marker；1：SP 21%B ～ 74%B elution sample；2：SP 75%B～100%B elution sample；3：SP 21%B～74%B elution sample western blot；4：SP 75%B～100%B elution sample western blot圖6 Western blot 結(jié)果Fig 6 Western blot results

1：SP純化后樣品；2：流穿；M:蛋白Marker；3：50 mmol/L咪唑洗脫峰；4：150 mmol/L咪唑洗脫峰；5:150 mmol/L咪唑洗脫峰；6：0.1 moL/L NaOH洗脫峰1：SP purified sample；2：Flow through liquid；M:Protein Marker；3：50 mmol/L imidazole elution peak；4：150 mmol/L imidazole elution peak；5:150 mmol/L imidazole elution peak；6：0.1 moL/L NaOH elution peak圖7 (Cu2+)金屬螯合層析柱純化結(jié)果Fig 7 (Cu2+) metal chelate chromatography column purification results

3.6 M1蛋白多抗的制備 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,成功分離出M1蛋白(28 kD)純品(圖9)，通過BCA方法測得制備的蛋白濃度為0.254 mg/mL。M1蛋白(28 kD)純品免疫昆明小鼠，第0、14、21、28和42天尾部采血分離血清。根據(jù)間接ELISA法測抗體效價顯示，小鼠抗體效價在免疫一周后持續(xù)增長，在免疫第42天抗體平均效價達到57左右，且達到最高(圖10)。

M:蛋白Marker；1:純化的重組融合蛋白；2-3:SUMO蛋白酶切后產(chǎn)物；4-5:蛋白純品M: Protein Marker；1: Purified recombinant fusion protein；2-3: SUMO protease cut product；4-5: Pure protein圖8 純化后的目的蛋白Fig 8 Purified target protein

M:蛋白Marker；1-2：聚丙烯酰胺凝膠塊中電洗脫M1蛋白純品M:Protein Marker；1-2：Pure M1 protein prepared by electroelution in polyacrylamide gel block圖9 純化的M1蛋白SDS-PAGE分析Fig 9 SDS-PAGE analysis of purified M1 protein

3.7 純化的目的蛋白的Western blot分析 M1目的蛋白的相對分子質(zhì)量為28 kD，最終純化的目的蛋白除了28 kD的預(yù)期條帶外，M1蛋白條帶下面還有3條條帶。將目的蛋白進行轉(zhuǎn)膜，一抗用M1蛋白(28 kD)免疫小鼠制備的抗體，二抗用HRP標記的羊抗鼠抗體，Western blot結(jié)果顯示，4條條帶都顯色(圖11)，均能被用M1蛋白(28 kD)免疫小鼠制備的抗體所識別，從而證明28 kD蛋白條帶下面的3條條帶和M1目的蛋白性質(zhì)一樣，都為M1目的蛋白，也由此得出，M1目的蛋白在表達的過程中發(fā)生蛋白降解，從而出現(xiàn)4條條帶。

圖10 不同時期抗M1蛋白(28 kD)的抗體滴度Fig 10 Antibody titers against M1 protein (28 kD) at different times

M:蛋白Marker；1-2：制備出的目的蛋白純品；3-4：制備出的目的蛋白純品免疫印跡M:Protein Marker；1-2：Pure protein of interest；3-4：Pure target protein western blot圖11 Western blot結(jié)果Fig 11 Western blot results

4 討論與結(jié)論

H3N2犬流感病毒是一類新近發(fā)現(xiàn)能感染犬的甲型流感病毒。犬流感病毒在犬間傳播迅速，能引起患犬咳嗽、流涕和發(fā)熱等呼吸系統(tǒng)疾病。當今社會犬作為一種伴侶動物，在現(xiàn)代人類生活中具有特殊的地位。由于犬和人及野生動物的親密接觸，給流感病毒的種間傳播提供了更多的機會。因此，犬攜帶流感病毒給人類健康、犬養(yǎng)殖業(yè)、寵物犬造成了巨大的威脅。目前，流感病毒的變異速度非?？?，常規(guī)流感疫苗幾乎每年都要進行調(diào)整，以適應(yīng)病毒的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)化，給疫苗的生產(chǎn)制備造成諸多不便。世界衛(wèi)生組織(WHO)依據(jù)當年全世界范圍流感病毒變化情況來預(yù)測并推薦下一年流感疫苗生產(chǎn)所用組分，預(yù)測準確度將會直接影響疫苗的保護效率，若預(yù)測失敗將會造成流感爆發(fā)流行的潛在威脅[9]。美國農(nóng)業(yè)部已批準一種H3N8的犬流感疫苗上市使用，用于犬流感的免疫預(yù)防，可有效降低犬群的整體發(fā)病率、病程和引起的肺部損傷，但尚不能提供100%的保護，韓國也已經(jīng)研制出H3N2的犬流感疫苗，但還未被批準上市，兩種疫苗均為滅活疫苗?，F(xiàn)在使用的治療犬流感病毒的抗病毒藥物有達菲、金剛乙胺和金剛烷胺，并且缺少患犬流感病犬的臨床治療報道，所以患病犬的用藥劑量需參考人的用藥劑量進行治療，因此，通用型犬流感抗體藥物的研究迫在眉睫[10]。M1蛋白在流感病毒中高度保守，是病毒粒子中最豐富和最保守的蛋白質(zhì)，每個病毒粒子的分子數(shù)量至少是HA蛋白的兩倍，基于保守抗原制備的抗體可以為多種流感亞型提供廣譜保護。

在現(xiàn)有的表達蛋白系統(tǒng)中，原核表達是通過構(gòu)建原核重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的蛋白表達系統(tǒng)，是最成熟、最穩(wěn)定的，具有容易進行實驗操作、時間短、成本低和獲取的目的蛋白表達量高等優(yōu)點。而真核表達系統(tǒng)，是通過構(gòu)建真核重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至細胞中，通過細胞的胞內(nèi)表達或者分泌表達目的蛋白，真核表達系統(tǒng)的加工、修飾體系更完善，目的蛋白能夠形成正確的空間結(jié)構(gòu)，但表達量低，時間周期長以及成本高。真核表達系統(tǒng)是表達生物活性蛋白及疫苗的理想選擇，而原核表達系統(tǒng)可以提供足夠的人工抗原用于診斷或不需要翻譯后修飾的蛋白的結(jié)構(gòu)分析[11]。鑒于實驗?zāi)康氖侵苽溆糜诤Y選抗體的具有免疫原性純品抗原，因此本實驗選擇了原核表達系統(tǒng)來表達CIV M1蛋白,并取得了滿意的結(jié)果。

此研究中，成功構(gòu)建了M1基因的原核重組表達質(zhì)粒pET-SUMO-M1，pET-SUMO表達質(zhì)粒能夠促進M1目的蛋白的可溶性表達，且質(zhì)粒帶有6×His標簽，使表達的M1目的蛋白易于用金屬螯合層析柱純化。重組融合蛋白預(yù)期大小為41 kD，但我們純化出的重組融合蛋白41 kD條帶下面始終緊連著3條大小不同的條帶，初步鑒定用HRP標記的抗His標簽的鼠的單克隆抗體經(jīng)Western blot分析顯示，四條蛋白都顯色，說明重組融合蛋白表達成功且四條帶可能都是重組融合蛋白。純化的重組融合蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后，成功將目的蛋白M1和融合蛋白分離，純化出的M1目的蛋白28 kD條帶下面同樣緊連著3條大小不同的條帶，為了進一步確定這3條帶是否均為目的蛋白，我們采用自制抗M1多抗來進行鑒定分析，用預(yù)期大小為28 kD的M1目的蛋白免疫小鼠制備的抗體為一抗，去孵育M1目的蛋白28 kD條帶及下面緊連著3條大小不同的條帶，經(jīng)Western blot分析，四條帶都顯色，再次鑒定證明，3條大小不同的條帶都能和預(yù)期大小為28 kD的M1目的蛋白免疫小鼠制備的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，也證明28 kD蛋白條帶及下面的3條大小不同條帶的蛋白性質(zhì)一樣，都為M1目的蛋白，也由此得出，M1目的蛋白在表達的過程中發(fā)生蛋白降解，從而出現(xiàn)4條目的條帶?？乖璏1目的蛋白的成功制備，為下一步制備通用型抗犬流感病毒抗體奠定了基礎(chǔ)。