酶制劑在玉米木薯混合原料酒精發(fā)酵中的應用研究

鄭 彬，劉 燕，張彩瑩，史利娟，劉 鉞，李 勇

（1.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南南陽473000； 2.河南天冠企業(yè)集團有限公司，河南南陽473000）

酒精發(fā)酵原料來源廣泛，既可以采用玉米、小麥、木薯等淀粉質(zhì)原料，甘蔗、糖蜜等糖質(zhì)原料，也可以使用木質(zhì)纖維素等纖維質(zhì)原料。受各種因素的影響，用于發(fā)酵酒精的淀粉質(zhì)原料主要是玉米和木薯，但由于玉米細胞壁含有部分非淀粉多糖，如纖維素、非纖維素多糖（戊聚糖、β-葡聚糖等），果膠多糖等；而木薯淀粉大部分是支鏈淀粉，含直鏈淀粉較少，這些因素的存在一定程度上會影響淀粉充分水解，不利于原料的高效利用[1-2]。

酸性蛋白酶可以分解淀粉質(zhì)原料中的蛋白質(zhì)為氨基酸，為酵母生長提供必需的氮源，既保證了酵母的生長，又可以使蛋白包裹的淀粉更易于水解，還不必消耗糖分轉化氨基酸[3]。木聚糖酶可以分解谷物原料細胞壁中的木聚糖，破壞原料細胞結構，促進淀粉、蛋白質(zhì)等有效成分的溶出，加速糖化酶等酶的作用[4]。普魯蘭酶是一種淀粉脫支酶，能夠快速使α-1,6糖苷鍵水解，專一性切開支鏈淀粉分支點，切下整個分支結構，形成直鏈淀粉，便于糖化酶糖化[5]。大量研究表明，在玉米、木薯等淀粉質(zhì)原料中添加酸性蛋白酶、木聚糖酶、普魯蘭酶等專用酶制劑，可以提高淀粉利用率[6-8]?，F(xiàn)在也有研究人員探索使用復合酶制劑對單一淀粉原料開展相關酒精發(fā)酵研究[9-10]。

本研究在前期不同酶制劑對單一淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵影響試驗的基礎上，選擇對玉米酒精發(fā)酵有明顯促進作用的酸性蛋白酶、木聚糖酶、普魯蘭酶，對木薯酒精發(fā)酵有明顯促進作用的普魯蘭酶、酸性蛋白酶開展玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵研究，以期對玉米、木薯混合原料酒精生產(chǎn)添加酶制劑提供參考，以提高原料利用率，增加企業(yè)經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）ZU108，本實驗室保存。

原料：木薯粉，粉碎粒度為0.25 mm；玉米粉，粉碎粒度為0.50 mm。均取自天冠集團燃料乙醇公司粉碎車間。

酶制劑：液化酶(30000 U/mL)，糖化酶(100000 U/mL)，酸性蛋白酶(100000 U/mL)，普魯蘭酶（2000 U/mL），木聚糖酶(70000 U/mL)，均取自天冠集團燃料乙醇公司乙醇廠。

試劑：葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉，均為市售分析純。

儀器設備：DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩箱，上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-6C生物顯微鏡，上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；DL-1萬用電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-C-1C超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；PL-403電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒精發(fā)酵試驗

按試驗方案，稱取原料（玉米粉∶木薯粉=8∶2），料水比1∶2.1，并用自來水調(diào)漿，攪拌均勻后用10%的硫酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH值至5.4～5.6，繼續(xù)攪勻，按15 U/g原料的比例加入液化酶，然后置于98℃恒溫水浴鍋內(nèi)液化2 h，取出冷卻至室溫后補水至原質(zhì)量。加入糖化酶，添加量為160 U/g原料；按試驗設計分別加入不同的酶制劑，接種后于33℃進行酒精發(fā)酵，發(fā)酵結束后進行檢測。

1.2.2 檢測方法

酒精度的測定：蒸餾-密度計法[11-12]。總糖的測定：斐林試劑滴定法[11-12]。外觀糖度的測定：密度計法[11-12]。酸度的測定：氫氧化鈉滴定法[11-12]。還原糖的測定：斐林試劑滴定法[11-12]。

2 結果與分析

2.1 酸性蛋白酶添加量對酒精發(fā)酵的影響

酸性蛋白酶在接種時添加，開展不同添加量的酒精發(fā)酵試驗，試驗結果見表1。

表1 酸性蛋白酶不同添加量酒精發(fā)酵結果

由表1可看出，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，不同發(fā)酵時段CO2失重均有明顯提高，殘還原糖、殘總糖均有明顯下降，酒精度顯著提高。當酸性蛋白酶的添加量小于12 U/g原料時，隨添加量的增加，殘還原糖、殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸上升。當添加量達到12 U/g原料時，殘還原糖、殘總糖均達到最低值，分別為0.22%、1.92%，酒精度達到最高值14.26%vol。此后再增加酶的用量，各項指標基本不變。試驗結果表明，添加酸性蛋白酶后，不僅CO2失重總量增加，而且可加快發(fā)酵速率，提高酒精度，酸性蛋白酶的適宜添加量為12 U/g原料。

2.2 普魯蘭酶添加量對酒精發(fā)酵的影響

普魯蘭酶在接種時添加，開展不同添加量的酒精發(fā)酵試驗，試驗結果見表2。

由表2可看出，隨著普魯蘭酶添加量的增加，不同發(fā)酵時段CO2失重均有提高，殘還原糖、殘總糖有明顯下降。當普魯蘭酶的添加量小于15 U/g原料時，隨添加量的增加，殘還原糖、殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸上升。當添加量達到15 U/g原料時，殘還原糖、殘總糖達到最低值，分別為0.24%、2.07%，酒精度達到最高值14.15%vol。此后再增加酶的用量，各項指標基本不變。試驗結果表明，添加普魯蘭酶后，CO2失重總量增加，發(fā)酵速率明顯加快，酒精度顯著提高，普魯蘭酶的適宜添加量為15 U/g原料。

表2 普魯蘭酶不同添加量酒精發(fā)酵結果

2.3 木聚糖酶添加量對酒精發(fā)酵的影響

木聚糖酶在接種時添加，開展不同添加量的酒精發(fā)酵試驗，試驗結果見表3。

由表3可看出，隨著木聚糖酶添加量的增加，不同發(fā)酵時段CO2失重均有提高，殘還原糖、殘總糖有明顯下降。當木聚糖酶的添加量小于150 U/g原料時，隨著添加量的增加，殘還原糖、殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸上升。當添加量達到150 U/g原料時，殘還原糖、殘總糖達到最低值，分別為0.45%、2.42%，酒精度達到最高值14.20%vol。此后再增加酶的用量，各項指標基本不變。試驗結果表明，添加木聚糖酶后，CO2失重總量增加，發(fā)酵速率加快，酒精度有明顯提高，木聚糖酶的適宜添加量為150 U/g原料。

表3 木聚糖酶不同添加量酒精發(fā)酵結果

2.4 復合酶制劑在玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵中的條件優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，選擇酸性蛋白酶、普魯蘭酶、木聚糖酶為影響因素，以成熟醪酒精度為響應值設計正交試驗，正交試驗因素水平見表4，正交試驗結果與方差分析見表5及表6。

由表5可知，不同酶制劑對玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵的影響程度為A＞C＞B，即酸性蛋白酶＞木聚糖酶＞普魯蘭酶，最優(yōu)組合為A3C3B3，即酸性蛋白酶16 U/g原料、木聚糖酶170 U/g原料、普魯蘭酶20 U/g原料。在此優(yōu)化條件下開展3批次驗證試驗，結果表明，發(fā)酵醪酒精度為14.65%vol。

由表6可知，酸性蛋白酶對發(fā)酵結果影響極顯著，木聚糖酶、普魯蘭酶對發(fā)酵結果影響顯著。

表4 正交試驗因素水平表

表5 酶制劑正交試驗結果及分析

表6 正交試驗結果方差分析

2.5 復合酶制劑對酒精發(fā)酵的影響

2.5.1 復合酶制劑對拌料濃度的影響

按不同料水比配料后進行發(fā)酵試驗，復合酶制劑在接種時添加，試驗結果見圖1。

圖1 添加復合酶制劑后拌料濃度對淀粉利用率的影響

由圖1可以看出，隨著拌料濃度提高，淀粉利用率先升后降，在相同料水比條件下，添加復合酶制劑后淀粉利用率明顯比對照樣高。結果表明，添加復合酶制劑不僅可以提高淀粉利用率而且原料拌料濃度可以適度增加，添加復合酶制劑后，料水比為1:2.1較適宜。

2.5.2 復合酶制劑對添加時間的影響

按料水比1∶2.1配料，復合酶制劑分別在液化后冷卻至50℃時添加（作用1 h）、接種時添加、接種后4 h時添加、接種后8 h時添加，開展酒精發(fā)酵試驗，試驗結果見表7。

由表7可看出，復合酶在液化后冷卻至50℃時添加，盡管此時的溫度與復合酶制劑的最適作用溫度接近，但易染菌，酸度較高，酒精度偏低。復合酶分別在接種后4 h、8 h進行添加，酸度略高，酒精度較高，但也存在染菌風險，并且酶制劑需要一定的作用時間才能代謝分解相應的底物，不能使氨基酸等物質(zhì)盡快被酵母利用，發(fā)酵效果略差。接種時添加復合酶，既避免了多次操作增加染菌風險，又可以保證酶制劑的作用時間，發(fā)酵終止時的酸度、殘總糖均較低，酒精度最高。試驗結果表明，復合酶制劑最佳添加時間為接種時添加。

表7 復合酶制劑不同添加時間對發(fā)酵結果的影響

2.5.3 復合酶制劑對酵母數(shù)量及醪液過濾速度的影響

按料水比1∶2.1配料，復合酶制劑在接種時添加開展酒精發(fā)酵試驗，試驗結果見表8。

表8 復合酶制劑對酵母菌數(shù)量及醪液過濾速度的影響

由表8可以看出，不同發(fā)酵時間，添加組酵母菌的數(shù)量均明顯高于對照組，分析可能是添加的酸性蛋白酶為酵母菌提供了更多氮源，加快其生長速度；添加組的醪液過濾速度比對照組略快，分析可能是木聚糖酶將高分子木聚糖分解成小分子木糖，醪液黏稠度降低，促進過濾速度加快。試驗結果表明，添加復合酶制劑可以提高酵母菌數(shù)量及醪液過濾速度。

2.5.4 復合酶制劑對發(fā)酵周期的影響

按料水比1∶2.1，接種時添加復合酶制劑，開展酒精發(fā)酵試驗，結果見表9。

表9 復合酶制劑對發(fā)酵周期的影響

由表9可以看出，不同發(fā)酵周期時間，添加組的殘總糖較對照組有明顯下降，酒精度比對照組有明顯提高。隨著發(fā)酵時間的延長，添加組殘總糖呈先下降后上升趨勢，酒精度表現(xiàn)出先上升后下降趨勢，當發(fā)酵進行到56 h時，殘總糖達到最低值2.00%，酒精度達到最高值14.55%vol，再延長發(fā)酵時間，殘總糖及酒精度基本不變。試驗結果表明，添加復合酶制劑后酒精發(fā)酵在56 h時基本結束，可以縮短發(fā)酵時間12 h。

2.5.5 復合酶制劑對發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的影響

按料水比1∶2.1，接種時添加復合酶制劑，發(fā)酵時間56 h，開展發(fā)酵培養(yǎng)基不同pH值時酒精發(fā)酵試驗，結果見表10。

表10 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵的影響

由表10可以看出，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基pH值的升高，呈現(xiàn)出殘總糖先降低后升高，酒精度先升高后降低趨勢，當pH5.0時，殘總糖最低為1.95%，酒精度最高為14.55%vol。試驗結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基適宜的初始pH值為5.0。

3 結論

3.1 通過單因素試驗考察了酸性蛋白酶、普魯蘭酶、木聚糖酶對玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵的影響，正交優(yōu)化試驗結果表明，最適添加量為酸性蛋白酶16 U/g原料、木聚糖酶170 U/g原料、普魯蘭酶20 U/g原料。

3.2 通過考察復合酶制劑對混合原料酒精發(fā)酵的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵條件：料水比為1∶2.1，復合酶制劑在接種時添加，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5.0，發(fā)酵時間為56 h。

3.3 采用玉米、木薯混合原料酒精發(fā)酵時，添加復合酶制劑可以增加酵母菌數(shù)量，提高拌料濃度，加快醪液過濾速度，縮短發(fā)酵周期，最終提高原料淀粉利用率，獲得更高經(jīng)濟效益。