腫瘤c-Met靶向分子成像探針的研發(fā)、制備與應(yīng)用進(jìn)展

燕 吉 韓兆國 孫夕林

近年來，腫瘤的發(fā)生率和病死率逐年上升，而目前常規(guī)檢查方法包括血清學(xué)、病理學(xué)、常規(guī)影像學(xué)等，均存在很多缺點(diǎn)，如血清學(xué)檢查的特異性不足，診斷不明確；病理活檢多只適用于位置表淺的病灶；常規(guī)影像學(xué)多在病灶出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化時(shí)方有一定價(jià)值，無法進(jìn)行早期診斷。

分子成像運(yùn)用影像學(xué)手段體現(xiàn)活體狀態(tài)下分子水平變化，支持定性定量研究，其特異性強(qiáng)，可以對(duì)腫瘤分子類型進(jìn)行準(zhǔn)確判別；分子成像探針可直達(dá)病灶，在出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化之前，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早期診斷。迄今為止，美國食品和藥物管理局已批準(zhǔn)一系列低分子抑制劑，用于各類受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)的靶向診療，而c-Met作為一類重要的RTK，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性方面扮演重要角色，針對(duì)c-Met的靶向治療受到越來越多的關(guān)注[1]。目前的研究熱點(diǎn)在于開發(fā)可以無創(chuàng)在體定量檢測(cè)c-Met水平的成像方案，而其關(guān)鍵又在新型c-Met分子探針的開發(fā)。本文主要目的是綜述報(bào)道的c-Met分子成像研究在探針設(shè)計(jì)、構(gòu)建及應(yīng)用等方面的特點(diǎn)及研究進(jìn)展。

一、c-Met通路

1.c-Met正常通路：c-Met是原癌基因c-Met的編碼產(chǎn)物，有酪氨酸激酶活性，其內(nèi)源性配體為肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。據(jù)報(bào)道，腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移與HGF及c-Met表達(dá)的增加高度相關(guān)。c-Met基因由Cooper等[2]研究發(fā)現(xiàn)，位于染色體7q21～q31。c-Met與HGF結(jié)合后，其在酪氨酸1234和1235處發(fā)生同型二聚化和磷酸化，隨后在1349和1356處發(fā)生[3,4]。磷酸化后，這些酪氨酸招募GRB2、PI3K、PLCγ等一系列信號(hào)分子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞周期[3,5]。

2.c-Met異常通路與腫瘤發(fā)生：c-Met通路在人體處于正常狀態(tài)時(shí)，可受到精準(zhǔn)調(diào)控而保持穩(wěn)定。然而，調(diào)控出現(xiàn)異常時(shí)往往伴隨著腫瘤的發(fā)生以及信號(hào)通路高度活化。腫瘤中的c-Met通路的異常激活，相關(guān)機(jī)制包括配體依賴性自分泌、旁分泌機(jī)制及配體非依賴性機(jī)制[6]。c-Met的異常激活引起細(xì)胞的增殖、侵襲，細(xì)胞凋亡的抑制以及血管生成[7]。在包括胃癌、乳腺癌、肺癌等諸多癌癥中，c-Met的突變、擴(kuò)增或過表達(dá)經(jīng)常發(fā)生，并且c-Met的過表達(dá)還與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)[8,9]。

二、c-Met檢測(cè)方法

c-Met的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有直接測(cè)序法、實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR,RTFQ-PCR)、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)[10]。直接測(cè)序法主要檢測(cè)c-Met突變，然而部分腫瘤患者如非小細(xì)胞肺癌患者c-Met突變的發(fā)生率較低，因此其對(duì)于篩查c-Met靶向治療獲益人群的指導(dǎo)意義有限；RTFQ-PCR和FISH主要檢測(cè)c-Met擴(kuò)增，但存在陽性率低等問題；IHC主要檢測(cè)c-Met過表達(dá)，敏感度高，但特異性差[11]。c-Met靶向分子成像可以無創(chuàng)、精確地檢測(cè)到腫瘤位置、靶點(diǎn)活化程度等異質(zhì)性信息，它高效、無害且可重復(fù)性強(qiáng)，而c-Met靶向分子探針的研發(fā)又是c-Met分子成像研究開展的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，其較傳統(tǒng)檢測(cè)方法有以下明顯優(yōu)勢(shì)：①探針前體可直接放射性標(biāo)記，具有清晰的結(jié)構(gòu)，可精確確定藥代動(dòng)力學(xué)信息及安全性信息等;②可提供更準(zhǔn)確的定量信息; ③探針易于修飾，適應(yīng)成像需求[12]。

三、c-Met分子成像探針

c-Met靶向分子探針的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、定點(diǎn)修飾等是制備穩(wěn)定、安全、高效探針的先決條件，探針的基本結(jié)構(gòu)由靶向基團(tuán)、連接部分和示蹤部分組成，通過連接物經(jīng)特定方法將靶向基團(tuán)與放射性同位素、順磁性物質(zhì)或光聲造影劑進(jìn)行連接，靶向基團(tuán)是探針最重要的結(jié)構(gòu)，包括特異性的抗體、蛋白、多肽及高親和力低分子化合物等。下文將依據(jù)靶向基團(tuán)分類分別闡述不同類別c-Met分子探針的構(gòu)建、優(yōu)化及應(yīng)用情況。

1.蛋白及抗體類：以HGF和各種不同抗c-Met單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)作為靶向基團(tuán)構(gòu)建c-Met探針，是目前應(yīng)用于靶向c-Met分子成像研究最廣泛的一類探針，其結(jié)合原理為抗原-抗體結(jié)合、受體-配體結(jié)合或者酶-底物結(jié)合等。鑒于抗c-Met抗體具有高特異性、高親和力、修飾承受度大等優(yōu)勢(shì)，此類探針在c-Met分子成像研究中得到廣泛應(yīng)用。Perk等[13]以DN-30作為靶向基團(tuán)，進(jìn)行89Zr標(biāo)記后用于c-Met靶向成像研究，DN-30是一種來源于鼠免疫球蛋白G2a的抗c-Met單克隆抗體。探針合成方法簡述如下：將去鐵胺琥珀酰化，再與DN30的賴氨酸殘基偶聯(lián)后，將pH值調(diào)至7.0，用89Zr標(biāo)記。在PD10柱上純化后得到終產(chǎn)物89Zr-N-sucDf-DN30。 連接介質(zhì)先與抗體偶聯(lián), 然后在偶聯(lián)物上標(biāo)記放射性核素，采用這種方法的優(yōu)點(diǎn)是放射性利用率較高。該制備方法不需特殊條件，原料易得。但步驟較多，相對(duì)耗時(shí)，且標(biāo)記產(chǎn)率較低。在靶向性驗(yàn)證過程中，c-Met陽性實(shí)驗(yàn)組攝取探針明顯高于陰性組，但在肝臟和脾臟有大量攝取，背景信號(hào)太高，致使圖像整體對(duì)比度稍低。Jagoda等[14]使用了改進(jìn)后的合成方法，不同的是換用了c-Met靶向治療性單臂單克隆抗體奧那妥珠單抗(onartuzumab)，它是具有納摩爾級(jí)別親和力的c-Met選擇性人源化單臂單克隆抗體，在小鼠腫瘤模型中證實(shí)對(duì)腫瘤生長有抑制作用且具備臨床轉(zhuǎn)化潛力[15]。探針89Zr-Df-onartuzumab的標(biāo)記產(chǎn)率>90%。

相比于DN30(部分激動(dòng)劑)，onartuzumab親和力和靶向特異性更強(qiáng)，生物抑制效應(yīng)更為完整。體外和體內(nèi)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其良好的靶向性、安全性和穩(wěn)定性。Li等[16]提出，無論是DN30還是onartuzumab，都具有完整的可結(jié)晶段(fragment crystalline,Fc)，需3～7天方能從體內(nèi)循環(huán)中清除。為克服這一缺點(diǎn)，該研究者對(duì)單克隆抗體的結(jié)構(gòu)加以修飾,選用單鏈可變片段，將其中的H2片段重組，在保證探針靶向性的基礎(chǔ)上明顯降低了探針的分子量。在連接介質(zhì)方面，區(qū)別于傳統(tǒng)的去鐵草酰胺(desferrioxamine,DFO)，Li等將DFO同馬來酰亞胺相鰲合，形成新的連接介質(zhì)馬來酰亞胺化去鐵草酰胺(maleimide-DFO)，這種改進(jìn)使核素-連接介質(zhì)-抗體聯(lián)結(jié)體更加穩(wěn)定，不易分解。該合成標(biāo)記產(chǎn)率為49%，放射化學(xué)純度為95%。該新型探針與傳統(tǒng)探針比較腫瘤攝取水平略低，但所得到圖像的對(duì)比度得到很大提高，得益于探針分子量的降低以加快了其在體內(nèi)的循環(huán)代謝。另外，前文描述的基于DN-30和onartuzumab的探針，結(jié)合抗體均為單價(jià)片段，該研究者證實(shí)單價(jià)片段不能抑制c-Met陽性細(xì)胞生長，說明需二價(jià)結(jié)合，該基于二價(jià)抗體片段的探針可將c-Met鎖定為禁止下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的構(gòu)象以實(shí)現(xiàn)高效結(jié)合。

HGF是c-Met的唯一的內(nèi)源性配體，依據(jù)受體-配體結(jié)合原理將其改造為靶向探針，可特異性結(jié)合c-Met靶點(diǎn)。曾有研究者直接將HGF作為分子顯像劑，研究病變的血流動(dòng)力學(xué)改變，實(shí)現(xiàn)了c-Met活化狀態(tài)的檢測(cè)，但未修飾的HGF將難以避免相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)及其潛在危害。Luo等[17]將HGF加以修飾，使其用于放射性核素標(biāo)記的成像研究。該研究者選用重組人HGF(recombinant human hepatocyte growth factor,rh-HGF)，將其與連接介質(zhì)p-SCNBn-NOTA綴合，pH值調(diào)至9.0，常溫下反應(yīng)1h。放射性標(biāo)記過程比較簡單，只需將64CuCl2溶在乙酸鈉緩沖液(pH值為6.5)中，加入到前體物質(zhì)中，常溫即可標(biāo)記。再經(jīng)PD10柱純化后制得。該探針的合成方法簡單，條件溫和，前體具有一定的臨床藥用基礎(chǔ)，更易于轉(zhuǎn)化。合成過程中使用了NOTA，一種大環(huán)類雙功能聯(lián)接劑，以其作為連接介質(zhì)可以提高探針穩(wěn)定性，這是由于配體的剛性架構(gòu)束縛了綴合位點(diǎn)與放射性核素。rh-HGF分子量顯著小于傳統(tǒng)單克隆抗體，因此，該探針的消除速率比傳統(tǒng)單克隆抗體類探針更高。脂蛋白是一類低分子量蛋白質(zhì)，其天然特性使其具備優(yōu)良的生物相容性，是作為靶向分子探針的理想材料。

Anticalin是一種基于人脂蛋白支架的新型生物治療藥物，能夠與抗原特異性結(jié)合，分子量比單克隆抗體小約8倍。von Scheltinga等[18]設(shè)計(jì)出一種靶向c-Met的anticalin，稱為PRS-110，采用89Zr標(biāo)記，標(biāo)記方法簡述如下：將89Zr-草酸鹽溶液用Na2CO3調(diào)節(jié)至pH值為4.0～4.5，兩者在室溫反應(yīng)3min，用過量的羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES，pH值為7.2)使溶液的pH值達(dá)到6.8～7.2，加入PRS-110并溫育60min，得到終產(chǎn)物89Zr-PRS-110。該探針HPLC分析結(jié)果表明，前體與放射性核素結(jié)合緊密，探針穩(wěn)定性較強(qiáng)。脂蛋白類探針是今后靶向c-Met靶向成像探針研發(fā)的一個(gè)新的潛在熱點(diǎn)。但此類探針的脂溶性較高，聚集于肝膽系統(tǒng)，對(duì)圖像對(duì)比度造成一定影響。

近年來，蛋白及抗體類c-Met分子探針的開發(fā)已取得較大進(jìn)步，但也存在以下問題：①體內(nèi)清除緩慢，這與探針靶向基團(tuán)的分子量過大有關(guān)，在保證靶向性能的前提下盡量降低靶向基團(tuán)的分子量將是未來發(fā)展的關(guān)鍵;②難以避免的免疫原性及相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)將帶來潛在的安全問題;③背景噪聲高，這與探針常積聚于肝膽系統(tǒng)有關(guān)。對(duì)探針進(jìn)行修飾，調(diào)整其水溶性，可在一定程度上克服此類問題。

2.多肽類：多肽是氨基酸以肽鍵形式連接在一起形成的生物高分子，c-Met特異性多肽以劑量依賴的方式與HGF 競(jìng)爭結(jié)合，具有改造為高效c-Met分子探針的潛力。多肽分子量較小，靶點(diǎn)結(jié)合效率較高，且易于結(jié)構(gòu)修飾，具有低毒、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。然而，有些以多肽結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的分子探針在實(shí)際合成和應(yīng)用過程中涉及到特殊試劑的使用，在一定程度上降低了探針安全性，限制了其臨床轉(zhuǎn)化?；谝陨戏矫妫挛膶⒎诸愄骄慷嚯念恈-Met探針的性能特點(diǎn)及在合成應(yīng)用過程中面臨的挑戰(zhàn)。從多肽庫中使用細(xì)胞因子受體篩選出的細(xì)胞因子模擬肽，具有活性強(qiáng)、分子量小等優(yōu)點(diǎn)，主要包括直鏈肽類和環(huán)肽類。Kim 等[19]從噬菌體多肽庫中篩選出c-Met抗原表位模擬肽NH2-Lys1-Ser2-Leu3-Ser4-Arg5-His6-Asp7-His8-Ile9-His10-His11-His12-Ac，將其命名為cMBP,即c-Met binding peptide。并證實(shí)該多肽可與c-Met特異性結(jié)合，通過一定的結(jié)構(gòu)改造將其與甘氨酸(G)或氨基辛酸(AOC)連接，用于125I標(biāo)記(125I-cMBP-G和125I-cMBP-AOC)的c-Met分子成像研究。前體制備及探針合成方法如下：在堿性條件下除去芴甲氧羰基(fluorene methoxycarbonyl,Fmoc)保護(hù)基團(tuán)后，多肽被分離出來，隨后連接G和AOC，生產(chǎn)出前體cMBP-GGG和cMBP-AOC，采用氯胺T碘標(biāo)法，加入氯胺T和Na125I后加入亞硫酸鈉終止反應(yīng)。放射化學(xué)純度為90%～95%。親和力測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)G或AOC修飾后的多肽探針與c-Met之間的親和力較修飾前明顯提高。125I-cMBP-GGG在腫瘤攝取方面優(yōu)于125I-cMBP-AOC，這說明連接部分含有3個(gè)甘氨酸可以提高探針的親和力，其原理是提高了探針的脂溶性及滯留能力。該研究者又將基于cMBP的探針研究拓展至光學(xué)成像領(lǐng)域，將cMBP-GGG和cMBP-AOC分別同花菁染料5.5 (cyanine dyes5.5,Cy5.5)共軛連接，制備出靶向c-Met光學(xué)成像探針[20]。Cy5.5是一種近紅外光染料，已廣泛應(yīng)用于光學(xué)分子成像研究，僅需亞納摩爾級(jí)別便足以滿足實(shí)驗(yàn)需求。該光學(xué)探針的合成方法簡述如下：Cy5.5馬來酰胺化后，與cMBP-GGG或cMBP-AOC混合，暗室室溫孵育6h。該探針可通過實(shí)時(shí)光學(xué)成像顯示c-Met的表達(dá)量。

Li等[21]使用18F標(biāo)記，基于多肽Met-pep1(YLFSVHWPPLKA)，合成新型分子探針18F-FP-Met-pep1。該研究者創(chuàng)新性地使用18F的丙酸鹽與多肽相連接，保證了多肽與放射性核素連接的穩(wěn)定性。經(jīng)二異丙基乙胺(diisopropylethylamine，DIPEA)及二氯甲烷(CH2Cl2)等物質(zhì)處理后，由乙醇洗脫制得。放射標(biāo)記率在55%以上，純度為97%。探針在腫瘤攝取能力強(qiáng)，可通過尿路迅速排出。雖然以上探針都取得了符合預(yù)期的結(jié)果，但直鏈肽類探針存在以下缺點(diǎn)：直鏈肽在生物體內(nèi)酶的作用下易被降解，影響探針的穩(wěn)定性；另外，直鏈肽的構(gòu)象柔性符合受體的構(gòu)象要求方面稍有不足，導(dǎo)致其受體選擇性方面不如環(huán)狀多肽。相對(duì)于直鏈肽，環(huán)肽具有較強(qiáng)的生物活性，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)決定其穩(wěn)定性及抗酶解能力均強(qiáng)于直鏈肽，生物利用度也遠(yuǎn)高于直鏈肽。

Burggraaf等[22]將一種商品化的c-Met特異性環(huán)肽AH-111972與連接肽GGGK連接后，以Cy5衍生熒光染料(Cy5.7)修飾，構(gòu)建了一種新型光學(xué)c-Met靶向探針GE-137，并將此探針用于熒光內(nèi)窺鏡成像，與病理切片比較，結(jié)果一致性良好，實(shí)現(xiàn)了臨床轉(zhuǎn)化。體外遺傳毒性和光毒性研究結(jié)果證實(shí)，該探針安全性較高。Arulappu等[23]選用GE-137的靶向多肽結(jié)構(gòu)，將其進(jìn)行18F標(biāo)記，制備了新型c-Met靶向分子探針。標(biāo)記采用兩步法，第一步：從經(jīng)輻照的靶水中回收18F的氟化物，然后洗脫到環(huán)烯烴共聚物反應(yīng)容器中，在120℃14N2氣流下干燥。 隨后與甲磺酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生18F-氟苯甲醛。第二步：將肽前體溶解于苯胺鹽酸鹽的水溶液中并加入到18F-氟苯甲醛中，通過18F親核取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)放射性標(biāo)記，得到粗產(chǎn)品，經(jīng)C18固相萃取柱純化后制得終產(chǎn)品18F-AH113804?？偤铣蓵r(shí)間為49min，放射化學(xué)純度>90%。此探針親和力高，且藥代動(dòng)力學(xué)特性良好。成像對(duì)比度高、背景噪聲低。靶向c-Met多肽類探針在安全性、可修飾性、合成工藝優(yōu)化等方面均優(yōu)于蛋白及抗體類，這與其生物相容性高、篩選方式及修飾優(yōu)化等因素有關(guān)。

3.低分子類：目前關(guān)于c-Met靶向分子成像的低分子類探針研究較少，且主要來源于低分子類c-Met酪氨酸激酶抑制劑。此類物質(zhì)常具有較高的水溶性，多經(jīng)腎臟排泄。因其分子量小、結(jié)合力強(qiáng)、消除速率高以及毒性小等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于探針研發(fā)。靶向c-Met低分子抑制劑SU11274，可在c-Met胞內(nèi)部分的ATP特定位點(diǎn)結(jié)合， Wiest等[24]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可在胞內(nèi)迅速聚集，阻斷c-Met磷酸化。Wu等[25]將其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，構(gòu)建了11C標(biāo)記的c-Met靶向探針。由于使用11C標(biāo)記，而11C的半衰期較短(t1/2=20min)，不適合進(jìn)行多步復(fù)雜的標(biāo)記，該研究者遂采用直接甲基化法，并未增加連接介質(zhì)，這點(diǎn)區(qū)別于其他c-Met靶向分子探針的構(gòu)建。雖無連接介質(zhì)，探針并未出現(xiàn)脫標(biāo)情況，說明此法可行。該探針標(biāo)記產(chǎn)率為90%～95%，放射化學(xué)純度>98%。成像結(jié)果顯示，探針在腹部的攝取明顯低于抗體及多肽類探針。

低分子抑制劑JNJ38877605、ARQ-197等均在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有抗腫瘤增殖的作用[26，27]，它們的結(jié)構(gòu)具備修飾潛力，可嘗試連接放射性核素，進(jìn)行PET成像研究。研發(fā)低分子類探針在制備流程中應(yīng)注意以下問題：在提高水溶性的過程中不能過多降低脂溶性，否則將影響跨膜遞送；人工合成后的低分子物質(zhì)不可忽視安全性評(píng)估；修飾時(shí)不可破壞原結(jié)構(gòu)等。

四、展 望

c-Met靶向分子成像研究對(duì)腫瘤c-Met異常表達(dá)水平的精準(zhǔn)定量意義重大，而探針的研發(fā)是成像研究的關(guān)鍵點(diǎn)和重點(diǎn)，直接影響著該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。近年來，c-Met分子探針在合成方法上不斷創(chuàng)新，篩選途徑和修飾手段持續(xù)多樣化，合成步驟不斷簡約化。通過“先標(biāo)記再偶聯(lián)”的方法，可以提高探針的放射性利用率；通過選用生物相容性強(qiáng)的片段，可以提高探針穩(wěn)定性。通過在尾端修飾3個(gè)甘氨酸，可以提高探針親和力。并且在保證不脫標(biāo)的情況下盡量縮短時(shí)間，從而降低半衰期過短的不良影響。目前，合成方法研究較成熟的是靶向c-Met 抗體類探針，高效的靶向性保證了探針的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。而低分子探針在藥代動(dòng)力學(xué)、診療一體化及臨床轉(zhuǎn)換等方面均優(yōu)于蛋白、抗體及多肽類，因此它將是c-Met靶向成像研究的重點(diǎn)和方向，但其合成方法復(fù)雜，需在合成和優(yōu)化結(jié)構(gòu)方面深入研究。相信蛋白組學(xué)和基因組學(xué)的不斷進(jìn)展，以及c-Met靶向探針制備方法的不斷改進(jìn)，將極大促進(jìn)c-Met分子探針開發(fā)和c-Met分子成像研究及其在臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用方面的進(jìn)展。