玉米肽螯合硒元素的制備工藝及其保肝作用研究

劉曉美，李圓圓，王升光，馬青琳，姜珊，高鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

蛋白質(zhì)是玉米蛋白粉中含量最高的成分，約占60%～70%，除此之外還含有大量的淀粉和纖維素[1]，以及豐富的微量元素。由于玉米蛋白缺少賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)等人體必需氨基酸[2]，有特殊的味道和色澤，水溶性差，目前國(guó)內(nèi)主要將其用于動(dòng)物飼料中或者直接處理排放，極大地浪費(fèi)了資源[3]。營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，蛋白質(zhì)需要通過(guò)酶解轉(zhuǎn)變成分子量更小的肽后才能被吸收。玉米肽含有13.18%的丙氨酸和17.15%亮氨酸，能夠減慢人體吸收乙醇的速度并加快其在體內(nèi)的代謝，從而起到解除乙醇毒性、保護(hù)肝臟的作用[4]。硒元素有“護(hù)肝衛(wèi)士”之稱，能夠抗氧化、抗自由基。具有生物活性的多肽通過(guò)共價(jià)化學(xué)鍵與金屬離子發(fā)生螯合，能夠顯著提高金屬元素在機(jī)體內(nèi)的吸收利用率[5-7]。王真真等[8]的研究表明，玉米肽螯合硒元素能夠增強(qiáng)醒酒保肝的作用。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于玉米肽-硒的研究，主要側(cè)重于富硒玉米蛋白酶解得到的富硒玉米肽[9]。曾慶瑞等[10]研究表明，功能活性肽螯合微量元素，既可減少微量元素的成本，又能使蛋白質(zhì)和微量元素的生物利用率都得到顯著提高。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究玉米蛋白經(jīng)過(guò)酶解成玉米肽后與硒元素的螯合。

本文通過(guò)考察玉米肽的酶解工藝，使玉米蛋白充分酶解獲得具有更高活性的玉米肽，并采用玉米肽與硒元素螯合工藝，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)。通過(guò)四氯化碳肝損傷的小鼠模型，確證其對(duì)肝臟的保護(hù)作用，為玉米肽的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(分析純，南京建成生物工程研究所)；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)(分析純，南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(CCl4)(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))；水飛薊素(Silymarin)(分析純，德國(guó)馬博士大藥廠)。

玉米蛋白(購(gòu)于陜西森弗天然制品有限公司)；胰蛋白酶(酶活≥ 100 000 U/g，上海源葉生物科技有限公司)；菠蘿蛋白酶(酶活≥100 000 U/g ，上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV1100，上海天美科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(68SM800，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(FE-20， 梅特勒儀器有限公司)；低溫高速離心機(jī)( 3K15 ，SIGMA 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)2017-0011)，100只雄性，體重(20±2 ) g，6～7周齡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 玉米蛋白酶解工藝流程

本實(shí)驗(yàn)先用蛋白酶水解蛋白原料，使其酶解為片段后再加入胰蛋白酶模擬小腸的水解環(huán)境，最終得到小分子的活性肽。實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 玉米蛋白酶解過(guò)程
Fig.1 Corn proteolysis process

2.2 玉米肽酶解工藝考察

2.2.1 玉米蛋白酶解工藝單因素試驗(yàn)

以蛋白質(zhì)的水解度為考察指標(biāo)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，分別考察加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、酶解 pH(5、6、7、8、9)以及酶解溫度(40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)對(duì)玉米蛋白水解度的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2.2 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定采用茚三酮法[11]。蛋白質(zhì)水解過(guò)程中被裂解的肽鍵數(shù)h(mmoL/g)與蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)htot(mmoL/g)之比稱為水解度(DH)。

DH=h/htot×100%。

2.2.3 菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)和酶解pH(D)4個(gè)因素，按L9(34)正交設(shè)計(jì)[12]優(yōu)選酶解工藝，各因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示，每組重復(fù)3次。

表1 菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米螯合硒元素的條件

2.3.1 玉米螯合硒元素的工藝流程

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化玉米肽螯合硒元素的制備工藝，實(shí)驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 玉米肽螯合工藝流程
Fig.2 Chelating process of corn peptide

2.3.2 玉米肽螯合硒元素螯合率的測(cè)定方法

采用 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺比色法[13]，對(duì)螯合物中硒含量進(jìn)行測(cè)定。

螯合率=M1/M0×100%，

其中，M1為螯合物中硒的含量，μg；M0為加入反應(yīng)體系中硒的總量，μg。

2.3.3 玉米肽-硒螯合工藝單因素試驗(yàn)

2.3.4 螯合工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)法

2.3.4.1 玉米肽-硒螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以玉米肽-硒螯合單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取螯合時(shí)間(X1)、螯合溫度(X2)、玉米肽-硒摩爾比(X3)以及螯合pH(X4)4個(gè)因素， 根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)螯合反應(yīng)的硒含量指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2。

表2 玉米肽-硒螯合工藝響應(yīng)面試驗(yàn)水平與編碼表

2.4 保肝作用研究

2.4.1 小鼠四氯化碳急性肝損傷模型的建立

小鼠四氯化碳急性肝損傷模型的建立參考文獻(xiàn)[14]。將50只昆明雄性小鼠，按照正常對(duì)照組、四氯化碳模型組、玉米肽組、玉米肽螯合硒元素組、陽(yáng)性對(duì)照水飛薊素組隨機(jī)分為5組，每組10只。各組小鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，使其在室溫下適應(yīng)一周。一周后，正常對(duì)照組和四氯化碳模型組每日按10 mL/kg灌胃生理鹽水1次，玉米肽組和玉米肽-硒敖合物組每日按200 mg/kg劑量灌胃。陽(yáng)性對(duì)照組按每日50 mg/kg劑量定時(shí)灌胃水飛薊素1次。連續(xù)灌胃15 d，末次給藥5 h，正常對(duì)照組腹腔注射橄欖油10 mL/kg，其余組別腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為0.125%的四氯化碳橄欖油溶液10 mL/kg。禁食不禁水12 h后，眼球取血，處死小鼠，剖腹取出肝臟，生理鹽水洗后，取肝制肝勻漿備用。在整個(gè)飼養(yǎng)周期內(nèi)，每2 d稱量一次體重，記錄小鼠的體重變化。

2.4.2 檢測(cè)指標(biāo)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定血清中 ALT、AST 活力以及肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(mg/g)= 肝臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。

2.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包中的單因素方差分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 菠蘿蛋白酶酶解正交試驗(yàn)

菠蘿蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 菠蘿蛋白酶酶解玉米蛋白工藝正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

表4 菠蘿蛋白酶酶解正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

由表3得出酶解影響因素由大到小順序?yàn)椋好纲|(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間；由均值K得出最佳因素組合為A2B2C2D1，即菠蘿蛋白酶酶解玉米蛋白的最佳的酶解工藝為：在酶解溫度 50 ℃，菠蘿蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%，酶解pH 7.0 條件下酶解3 h。由表4得出影響因素與表3結(jié)果一致，且由p值可知，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響具有顯著性差異。

3.2 胰蛋白酶酶解正交試驗(yàn)

胰蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 胰蛋白酶酶解玉米蛋白工藝正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

表6 胰蛋白酶酶解正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

由表5可以得出酶解影響因素由大到小順序?yàn)椋好纲|(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解 pH、酶解時(shí)間；由均值K得出最佳因素組合為A3B1C2D2，即胰蛋白酶的最佳酶解工藝為：以胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，酶解溫度為40 ℃、酶解pH 8.0條件下酶解 3 h。

由表6中F值可知，影響因素與表5結(jié)果一致，且由P值可知，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響具有顯著性差異。

3.3 玉米肽酶解最佳工藝

取玉米蛋白適量，加入純水使底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的菠蘿蛋白酶時(shí)，在 50 ℃酶解3 h；待完成后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為8.0，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的胰蛋白酶在40 ℃、轉(zhuǎn)速 45～50 r/min 酶解3 h，煮沸，高溫殺酶 15 min,迅速冷卻至室溫。測(cè)定玉米肽的水解度為38.15%。

3.4 玉米肽-硒螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化玉米肽-硒螯合工藝結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化螯合工藝結(jié)果見(jiàn)表7,其中X1為螯合時(shí)間，X2為螯合溫度，X3為玉米肽與硒摩爾比，X4為螯合pH。

表7 響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

續(xù)表7

采用Design Expert.V8.0.6 軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，建立各因素與螯合率之間的多元二次響應(yīng)面回歸模型為：

Y=41.37+0.63X1+9.89X2-1.25X3+1.47X4-0.13X1X2+0.38X1X3+0.020X1X4-0.050X2X3+0.22X2X4

+2.44X3X4-2.54X12-2.34X22-6.22X32-13.50X42

表8 二次回歸模型的方差分析結(jié)果

注：P<0.05，表明差異顯著；P<0.01 表明差異極其顯著

由表8可知，模型擬合程度較好。

3.4.2 響應(yīng)曲面圖分析

響應(yīng)曲面的分析圖形是一個(gè)三維空間圖，可以直觀地反映出各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響。在本試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，各因素對(duì)玉米肽-硒螯合率影響的二維等高線見(jiàn)圖3。

圖3 兩因素交互作用對(duì)玉米肽-硒螯合率的影響Fig. 3 Effect of two-factor interactions on chelation rate of corn peptide-selenium

圖3可以直觀地看出，螯合pH與螯合時(shí)間對(duì)螯合率的影響以及螯合pH與玉米肽-硒摩爾比這兩組中兩個(gè)因素交互作用較強(qiáng)，其余試驗(yàn)因素之間交互作用均不顯著。試驗(yàn)因素pH、肽-硒摩爾比是影響螯合率的主要因素。

3.5 保肝作用結(jié)果及分析

3.5.1 小鼠體重變化

在整個(gè)飼養(yǎng)周期內(nèi)，每2 d稱量一次體重，所有小鼠體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，組間未見(jiàn)顯著差異。

3.5.2 玉米肽螯合硒元素對(duì)四氯化碳致肝損傷小鼠血清中 ALT、AST活力以及肝臟指數(shù)的影響

表9 玉米肽螯合硒元素對(duì)四氯化碳致肝損傷小鼠血清中 ALT、AST 活力以及肝臟指數(shù)的影響(n=10)

注： a 表示與四氯化碳模型組比較差異顯著(P<0.05)，b 表示與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，同列上標(biāo)的不同小寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)

由表9可以看出，與四氯化碳模型組相比，玉米肽組、玉米肽螯合硒元素組的血清中 ALT 活性、AST 活性、肝臟指數(shù)均極顯著降低(P<0.05)，且玉米肽螯合硒元素組的血清中 ALT 活性、AST 活性、肝臟指數(shù)較玉米肽組明顯降低(P<0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照水飛薊素保肝效果相當(dāng)。

4 結(jié)語(yǔ)

該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了玉米肽酶解以及玉米肽螯合硒元素的工藝，確定了最佳工藝，并通過(guò)給藥四氯化碳肝損傷的小鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)螯合微量元素硒的玉米肽對(duì)肝損傷的改善作用增強(qiáng)。該研究證明了玉米蛋白可以具有更高的藥用價(jià)值，未來(lái)會(huì)有更廣闊的發(fā)展空間。