卵裂期形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)在選擇性單囊胚移植時(shí)的參考價(jià)值

張慶 邱乒乒 紀(jì)紅 王龍梅 石健 丁露 王旭 蘇志英 李萍

廈門市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，廈門市生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福建廈門361003）

隨著培養(yǎng)條件的提高，胚胎在體外培養(yǎng)至囊胚期進(jìn)行移植，已經(jīng)成為大多數(shù)生殖中心的常規(guī)應(yīng)用技術(shù)。自然狀態(tài)下，受精卵在輸卵管內(nèi)發(fā)育至桑葚胚（早期囊胚）后，隨著輸卵管的蠕動(dòng)才進(jìn)入宮腔。因此，胚胎過早的進(jìn)入會(huì)導(dǎo)致其與子宮內(nèi)膜“種植窗”的非同步化，從而影響胚胎著床。因此囊胚移植提高了胚胎-子宮內(nèi)膜同步性，更符合生理性著床過程，可以提高妊娠率。而且將胚胎延長(zhǎng)體外培養(yǎng)至囊胚期，可以淘汰具有遺傳缺陷和發(fā)育潛能差的胚胎。目前觀點(diǎn)普遍認(rèn)為，多胎妊娠是輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）治療的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥。隨著ART 技術(shù)的進(jìn)步，在提高妊娠率的同時(shí)，降低多胎率已成為臨床工作者需要解決的難題。選擇性單囊胚移植是減少多胎妊娠率的最有效方法，關(guān)鍵在于如何挑選出具有發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)囊胚。形態(tài)學(xué)評(píng)分是目前應(yīng)用最為普遍的囊胚評(píng)級(jí)的方法。由于囊胚發(fā)育是多階段的過程，因此僅通過囊胚期的形態(tài)對(duì)其發(fā)育潛能進(jìn)行評(píng)估尚不夠準(zhǔn)確。當(dāng)前囊胚的卵裂期評(píng)級(jí)對(duì)妊娠結(jié)局影響的觀點(diǎn)尚存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，D3 評(píng)級(jí)較差的胚胎所形成的囊胚比D3 評(píng)級(jí)為優(yōu)質(zhì)胚胎所形成囊胚的妊娠率低，且兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［1］。也有研究［2］表明，卵裂期胚胎D2 和D3 的評(píng)級(jí)并不能夠預(yù)測(cè)囊胚的妊娠結(jié)局。因此，本研究回顧性分析本中心340 例行單囊胚凍胚移植患者的臨床資料，通過比較不同D2 卵裂期評(píng)級(jí)和不同D3 卵裂期評(píng)級(jí)對(duì)應(yīng)囊胚的妊娠結(jié)局，旨為選擇發(fā)育潛能更好的囊胚進(jìn)行單囊胚移植，降低多胎妊娠率提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年6月至2017年10月在本中心進(jìn)行選擇性單囊胚復(fù)蘇周期移植的340例患者，要求女方年齡≤35 歲，取卵周期數(shù)≤2 且移植次數(shù)≤3。根據(jù)囊胚的D2 和D3 天卵裂期評(píng)級(jí)筆者將患者分為六組：A 組D2 評(píng)級(jí)為2 級(jí)或2.5 級(jí)，n= 166；B 組D2 評(píng)級(jí)為3 級(jí)或3.5 級(jí)，n= 160；C 組D2 評(píng)級(jí)為4 級(jí)，n= 14；D 組D3 評(píng)級(jí)為2 級(jí)或2.5級(jí)，n= 81；E 組D3 評(píng)級(jí)為3 級(jí)或3.5 級(jí)，n= 186；F 組D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)，n=73。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵方案 根據(jù)患者年齡，卵巢功能情況選用常規(guī)長(zhǎng)方案、拮抗劑及微刺激方案。

1.2.2 胚胎評(píng)分和囊胚評(píng)分 1 級(jí)：D2 為4 細(xì)胞，D3 為8 細(xì)胞；卵裂球大小均勻、形狀規(guī)則，排列均勻，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)空泡，無(wú)多核現(xiàn)象，碎片不超過5 %。2 級(jí)：D2 為3～5 細(xì)胞（多為4 細(xì)胞），D3 為7～9 細(xì)胞（多為8 細(xì)胞）；卵裂球均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)大空泡，無(wú)多核現(xiàn)象，碎片占10%～15%。2.5 級(jí)：D2 為3～5細(xì)胞（多為4 細(xì)胞），D3 為7～9 細(xì)胞（多為8 細(xì)胞）；卵裂球均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)大空泡，無(wú)多核現(xiàn)象，碎片占15%～20%。3 級(jí)：D2 為2～6 細(xì)胞，D3 為6～12 細(xì)胞；卵裂球均勻/不均勻、數(shù)目均等/不均等，細(xì)胞質(zhì)中有較多空泡；無(wú)多核現(xiàn)象；碎片占20%～25%。3.5級(jí)：D2 為2～6 細(xì)胞，D3 為6～12 細(xì)胞；卵裂球均勻/不均勻、數(shù)目均等/不均等，細(xì)胞質(zhì)中有較多空泡；無(wú)多核現(xiàn)象；碎片占25%～30%。4 級(jí)：D2為＞6 細(xì)胞或未卵裂，D3 ＜6 或＞12 細(xì)胞；卵裂球不均勻、數(shù)目不均等，細(xì)胞質(zhì)不均一、有大量空泡；有多核現(xiàn)象，碎片占＞30%。囊胚評(píng)分參照Gardner 等的囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 囊胚凍融 采用玻璃化冷凍法（Origio，美國(guó)）。

1.2.4 囊胚冷凍 對(duì)囊胚行激光皺縮，釋放囊腔液，室溫下轉(zhuǎn)移入玻璃化冷凍液1，平衡5～10 min，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液2，反復(fù)沖洗數(shù)次，并在1 min 內(nèi)將囊胚放置在Cryotop 前端。迅速浸入液氮，套上蓋子，最后投入液氮罐中保存。

1.2.5 囊胚解凍 囊胚解凍：室溫下將囊胚迅速?gòu)囊旱薪氲筋A(yù)熱至37 ℃的解凍液1 中，1 min后轉(zhuǎn)移至解凍液2，平衡3 min 后轉(zhuǎn)移至解凍液3，平衡3 min 后轉(zhuǎn)移至解凍液4，平衡3 min 后轉(zhuǎn)移至解凍液4，3 min 后移入囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)等待移植。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo) 種植率、臨床妊娠率、多胎率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率。種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)× 100%；臨床妊娠率= 臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)× 100%；多胎率= 雙、多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠數(shù)× 100%；異位妊娠率= 異位妊娠數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%；活產(chǎn)率=分娩活嬰（雙、多胎按1 例計(jì)算）/移植周期數(shù)× 100%；流產(chǎn)率=（早期流產(chǎn)數(shù)+ 晚期流產(chǎn)數(shù)）/臨床妊娠數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，平均值比較采用Kruskal Wallis 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料中率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)1≤T≤5 時(shí)，采用校正卡方檢驗(yàn)。若有一個(gè)格子的理論頻數(shù)＜1 則用Fisher's 確切概率法，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵裂期評(píng)級(jí)組的患者臨床資料比較患者的年齡、不孕年限、BMI、內(nèi)膜厚度及IVF受精方式所占比例、首次取卵周期比例和首次移植周期比例等，在本中心評(píng)級(jí)為1 級(jí)的胚胎非常罕見，即使有這樣的胚胎也會(huì)優(yōu)先進(jìn)行鮮胚移植或者冷凍，因此目前尚無(wú)1 級(jí)胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的數(shù)據(jù)。根據(jù)囊胚的D2 和D3 天評(píng)級(jí)筆者將其分為六組：由表1及表2所示。組間的一般臨床資料年齡、不孕年限、BMI、內(nèi)膜厚度、IVF 受精方式比例等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是在表1中，首次移植周期比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在表2中的首次取卵周期比例和首次移植周期比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同D2 評(píng)級(jí)組患者因素的比較Tab.1 Clinical characteristics of different embryo quality at day 2 ±s

表1 不同D2 評(píng)級(jí)組患者因素的比較Tab.1 Clinical characteristics of different embryo quality at day 2 ±s

注：*P ＜0.05，字母不同表示兩組數(shù)據(jù)之間有差異

組別A 組B 組C 組P 值例數(shù)160 166 14-年齡（歲）30.01±4.33 31.03±4.25 31.71±5.09 0.056不孕年限（年）3.77±2.59 4.28±2.93 4.71±4.10 0.256 BMI（kg/m2）21.02±2.65 21.34±2.86 22.92±3.24 0.673內(nèi)膜厚度（mm）9.63±1.61 9.90±1.89 9.78±2.10 0.756 IVF 受精方式（%）84.38（135/160）84.94（141/166）85.71（12/14）0.984首次取卵周期比例（%）93.75（150/160）96.39(160/166)85.71(12/14)0.175首次移植周期比例（%）70.00a(112/160)53.61b(89/166)21.43c(3/14)＜0.001

表2 不同D3 評(píng)級(jí)組患者因素的比較Tab.2 Clinical characteristics of different embryo quality at day 3 ±s

表2 不同D3 評(píng)級(jí)組患者因素的比較Tab.2 Clinical characteristics of different embryo quality at day 3 ±s

注：*P ＜0.05，字母不同表示兩組數(shù)據(jù)之間有差異

組別例數(shù)D 組E 組F 組P 值81 186 73-年齡（歲）30.20± 4.4 30.37± 4.28 31.55± 4.37 0.129不孕年限（年）3.64± 2.34 4.13± 2.80 4.34± 3.36 0.480 BMI（kg/m2）20.98± 2.52 21.29± 2.88 21.46± 2.89 0.651內(nèi)膜厚度（mm）9.71± 1.62 9.89± 1.81 9.51± 1.83 0.320 IVF 受精方式（%）79.01（64/81）87.10（162/186）84.93（62/73）0.240首次取卵周期比例（%）95.06b（77/81）97.31a（181/186）87.67b（64/73）0.015首次移植周期比例（%）80.25a（65/81）60.75b（113/186）35.62c（26/73）＜0.001

2.2 卵裂期D2 天不同評(píng)級(jí)與單囊胚移植的臨床妊娠結(jié)局和新生兒出生情況的比較 從表3中可得，A、B、C 3 組間HCG 陽(yáng)性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、出生嬰兒性別比及雙胎率等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。卵裂期D2天評(píng)級(jí)為3 級(jí)的優(yōu)質(zhì)囊胚比例明顯低于D2 天評(píng)級(jí)為2 級(jí)和4 級(jí)組（優(yōu)質(zhì)囊胚率：87.5%、63.25%、71.43%，P＜0.05）。卵裂期D2 天評(píng)級(jí)2 級(jí)、3 級(jí)、4 級(jí)，隨著評(píng)級(jí)的降低，3 組對(duì)應(yīng)的臨床妊娠率存在越來(lái)越低的趨勢(shì)（56.25%、51.20%、35.71%），但是三者并差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)D2評(píng)級(jí)為4 級(jí)時(shí)，其活產(chǎn)率最低為21.43%，且其流產(chǎn)率較高（24.44%、23.53%、40%），3 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同D2 評(píng)級(jí)組妊娠結(jié)局的比較Tab.3 Clinical outcomes of different embryo quality at day 2

2.3 卵裂期D3 天不同評(píng)級(jí)與單囊胚移植的臨床妊娠結(jié)局和新生兒出生情況的比較 HCG 陽(yáng)性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及雙胎率等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。出生嬰兒性別比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是有可能是因?yàn)闃颖玖可偎鶎?dǎo)致的結(jié)果，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)卵裂期D3 天評(píng)級(jí)分為3 組，3 組之間的優(yōu)質(zhì)囊胚比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（優(yōu)質(zhì)囊胚率：91.36%、74.19%、58.9%，P＜0.05）。

表4 不同D3 評(píng)級(jí)組妊娠結(jié)局的比較Tab.4 Clinical outcomes of different embryo quality at day 3

2.4 不同D2 天評(píng)級(jí)和D3 天評(píng)級(jí)來(lái)源囊胚移植后出生嬰兒的身高和體重的影響 本次隨訪的134個(gè)嬰兒均無(wú)出生缺陷。根據(jù)表5和表6可得，出生嬰兒的體重和身高在卵裂期D2 評(píng)級(jí)3 組間及第D3 卵裂期評(píng)級(jí)3 組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表5 不同D2 評(píng)級(jí)組活產(chǎn)嬰兒的比較Tab.5 Comparison of live births in different embryo quality at day 2 ±s

表5 不同D2 評(píng)級(jí)組活產(chǎn)嬰兒的比較Tab.5 Comparison of live births in different embryo quality at day 2 ±s

組別A 組B 組C 組χ2（F）值P 值出生嬰兒體重（g）3 218.30±606.66 3 350.19±500.9 3 426.67±955.84 0.984 0.376身長(zhǎng)（cm）49.51±2.44 50.20±1.63 51.33±5.33 4.595 0.100

表6 不同D3 評(píng)級(jí)組活產(chǎn)嬰兒的比較Tab.6 Comparison of live births in different embryo quality at day 3 ±s

表6 不同D3 評(píng)級(jí)組活產(chǎn)嬰兒的比較Tab.6 Comparison of live births in different embryo quality at day 3 ±s

組別D 組E 組F 組χ2（F）值P 值出生嬰兒體重（g）3 195.69± 608.41 3 291.21± 564.19 3 365.00± 530.03 0.642 0.528身長(zhǎng)（cm）49.48± 1.70 49.81± 2.30 50.50± 1.86 4.686 0.096

2.5 根據(jù)D3 天評(píng)分為四級(jí)的卵裂球數(shù)目不同進(jìn)行分組，兩組間患者一般情況比較 由表7所示，三組患者的不孕年限、BMI、內(nèi)膜厚度、首次取卵周期比例和首次移植周期比例等一般情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是三組間患者年齡存在顯著差異，兩組之間的患者平均年齡N ＜6 組平均年齡為32.65，N≥6 組時(shí)年齡為30.59，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 不同卵裂球數(shù)的D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)胚胎養(yǎng)成囊胚后的妊娠結(jié)局 結(jié)果如表8所示，三組間除了優(yōu)質(zhì)囊胚比例外，分別為79.49%，35.29%和80.77%，其他各項(xiàng)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是從數(shù)據(jù)中可以看到N≥6 且D2 天評(píng)級(jí)不是4 級(jí)的胚胎，其臨床妊娠率、HCG 陽(yáng)性率、活產(chǎn)率等均高于其他兩組，但是并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表7 D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)胚胎根據(jù)卵裂球數(shù)目分組一般情況比較Tab.7 Comparison of D3 grade 4 embryos group based on the number of blastomeres ±s

表7 D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)胚胎根據(jù)卵裂球數(shù)目分組一般情況比較Tab.7 Comparison of D3 grade 4 embryos group based on the number of blastomeres ±s

注：*P ＜0.05，字母不同表示兩組數(shù)據(jù)之間有差異

組別例數(shù)P 值Ⅰ（N≥6）Ⅱ（N＜6）Ⅲ（N≥6 且剔除D2 為4 級(jí)）Ⅳ（N＜6 且剔除D2 為4 級(jí)）39 34 26 32年齡*（歲）30.59± 4.36a 32.65± 4.16b 30.35± 4.07a 32.5± 4.22b不孕年限（年）4.13± 3.38 4.59± 3.38 3.62± 2.93 4.75± 3.41 BMI（kg/m2）21.80± 3.33 21.06± 2.27 20.91± 3.21 21.18± 2.28內(nèi)膜厚度（mm）9.75± 1.73 9.23± 1.91 9.78± 1.52 9.18± 1.96 0.301 0.088 P 值-0.008 0.324 0.616 0.129首次取卵周期比例（%）87.18（34/39）88.24（30/34）88.46（23/26）87.5（28/32）1.000（Ⅰ和Ⅱ）1.000（Ⅲ和Ⅳ）首次移植周期比例（%）41.03（16/39）29.41（10/34）50.00（13/26）28.13（9/32）0.301（Ⅰ和Ⅱ）0.088（Ⅲ和Ⅳ）

2.7 影響活產(chǎn)率相關(guān)因素的Logistic 回歸分析將影響活產(chǎn)率的幾個(gè)因素：年齡、D2 卵裂期評(píng)級(jí)、D3 卵裂期評(píng)級(jí)、優(yōu)質(zhì)囊胚率作為自變量分析對(duì)活產(chǎn)率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著影響活產(chǎn)率（均P＜0.05），而年齡和卵裂期評(píng)級(jí)與活產(chǎn)率之間無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。其中，優(yōu)質(zhì)囊胚率是影響活產(chǎn)率的首要因素（OR= 0.510，95%CI：0.288～0.903）。見表10。

2.8 影響流產(chǎn)率相關(guān)因素的Logistic 回歸分析將影響流產(chǎn)率的幾個(gè)因素：年齡、D2 卵裂期評(píng)級(jí)、D3 卵裂期評(píng)級(jí)、優(yōu)質(zhì)囊胚率作為自變量分析對(duì)流產(chǎn)率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：年齡、D2 卵裂期評(píng)級(jí)、D3卵裂期評(píng)級(jí)、優(yōu)質(zhì)囊胚率并不是流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P＞0.05）。見表11。

表8 D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)胚胎不同卵裂球分組臨床結(jié)局比較Tab.8 Comparison of clinical outcomes in different D3 grade 4 embryos group based on the number of blastomeres

表9 D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)胚胎且D2 評(píng)級(jí)為可用胚不同卵裂球分組臨床結(jié)局比較Tab.9 Comparison of clinical outcomes in different D3 grade 4 embryos group and D2 rating for available embryos based on the number of blastomeres

表10 影響活產(chǎn)率各因素的相關(guān)性分析Tab.10 Logistic regression for predicting the factors that affect live birth rate

表11 影響流產(chǎn)率各因素的相關(guān)性分析Tab.11 Logistic regression for predicting the factors that affect pregnancy loss rate

3 討論

隨著技術(shù)的進(jìn)步，在提高妊娠率的前提下，降低多胎妊娠率已經(jīng)成為人工助孕需要考慮的問題。多胎妊娠會(huì)帶來(lái)多種并發(fā)癥如：產(chǎn)婦高血壓、未足月產(chǎn)和早產(chǎn)的概率升高，新生兒體重較低等問題，嚴(yán)重威脅著母嬰安全［3］。單胚胎移植可以有效的降低多胎率，目前較多文獻(xiàn)的報(bào)道也支持這一觀點(diǎn)。研究表明，單個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚移植與雙優(yōu)質(zhì)囊胚移植在妊娠率方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但能顯著降低多胎率［4］。目前單囊胚移植逐漸成為一種較為理想的移植策略［5］。本研究進(jìn)行單囊胚移植一共340 例，其中3 例生育雙胎，雙胎率為1.67%（3/180），雙胎妊娠率顯著降低。

因此，如何篩選出具有更好發(fā)育潛能的囊胚成為了筆者需要解決的重點(diǎn)。孟慶霞等［6］對(duì)單囊胚復(fù)蘇周期移植的586 例患者進(jìn)行回顧性研究表明：優(yōu)先挑選發(fā)育至第5 天且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量和滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量高的胚胎可以獲得高活產(chǎn)率和低流產(chǎn)率，ICM-A 組的活產(chǎn)率顯著高于ICM-B 組（59.7%vs.43.4%，P＜0.05），而流產(chǎn)率顯著低于ICM-B 組（7.7%vs.17.5%，P＜0.05）。但是任新玲等回顧分析105 例復(fù)蘇周期單囊胚移植患者的臨床資料認(rèn)為，第5、6 天囊胚復(fù)蘇后存活率、移植后妊娠率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（98.0%，54.5%vs.97.0%，52.5%）。結(jié)果表明，囊胚的評(píng)級(jí)與復(fù)蘇周期單囊胚移植妊娠率有關(guān)，其中ICM 評(píng)分與妊娠結(jié)局更具有相關(guān)性。囊胚的發(fā)育速度與妊娠率沒有相關(guān)性［7］。本研究中利用D2 和D3 的卵裂期胚胎評(píng)級(jí)進(jìn)行分組，研究不同卵裂期評(píng)級(jí)的囊胚是否有差異。研究結(jié)果表明卵裂期的評(píng)級(jí)結(jié)果與囊胚的妊娠結(jié)局并沒有相關(guān)性，這樣的結(jié)果與HERBEMONT 的研究結(jié)論相似［2］。但是分析表3中的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)D2 天評(píng)級(jí)為4 級(jí)的囊胚，其臨床妊娠率為35.71%，低于評(píng)級(jí)為2 級(jí)和3 級(jí)組：56.25%和51.20%。而且C 組中的流產(chǎn)率也高于A組和B 組。

進(jìn)一步分析本研究中D2 評(píng)級(jí)為4 級(jí)的胚胎，其中2 例為碎片率較高，D2 評(píng)級(jí)：不清C4，D3 評(píng)級(jí)：不清C4。其余12 例D2 的卵裂球數(shù)均≥7，D3卵裂球≥9。分析造成這樣的原因：可能是胚胎發(fā)育前期速度過快（D2 卵裂球數(shù)目N≥7）或胚胎碎片率大于30%，這樣的胚胎形成染色體正常囊胚的概率較低。這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，AZZARELLO 等［8］通過time-lapse 研究第二天移植4 細(xì)胞的胚胎，其妊娠率明顯高于卵裂球數(shù)目不等于4 細(xì)胞的胚胎。通過time-lapse 的再評(píng)估，筆者觀察到，在本臨床移植胚胎中，有一半被常規(guī)評(píng)分為少于或者多于4 個(gè)細(xì)胞，表現(xiàn)出異常卵裂球分裂和碎裂率＞25%（發(fā)生率分別為51.4%和45.6%）。然而胚胎評(píng)為4 細(xì)胞時(shí)，只有一小部分呈現(xiàn)這樣的模式（8.4%）。因此，選擇4 細(xì)胞胚胎移植是避免異常的卵裂球分裂和碎裂率＞25%的有效方法，因?yàn)槌Ｒ?guī)評(píng)分無(wú)法檢測(cè)到這兩種不規(guī)則現(xiàn)象。另外根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雖然平均卵裂球數(shù)目較多的胚胎更易于形成囊胚。但是進(jìn)一步研究表明，D3 天卵裂球數(shù)目大于9 的胚胎非整倍體率顯著提高［9］。ZHAN 等［10］認(rèn)為其原因可能是胚胎發(fā)生了直接不均等分裂，這會(huì)導(dǎo)致發(fā)生整倍體的幾率降低，發(fā)生復(fù)雜染色體異常的比例提高，移植時(shí)應(yīng)當(dāng)避免選擇這樣的卵裂期胚胎，建議對(duì)其進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。因此，本研究中D2 發(fā)育速度較快的胚胎可能存在較高水平的染色體異?，F(xiàn)象，但是比較其臨床妊娠結(jié)局并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析原因認(rèn)為本研究中的D2 評(píng)級(jí)為4 級(jí)組樣本量較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入研究證實(shí)這一結(jié)論。從表1和表2的數(shù)據(jù)中分析可得，A、B 和C 組以及D 組、E 組和F 組的首次移植比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析導(dǎo)致卵裂期評(píng)級(jí)為4 級(jí)樣本量少且首次移植比例低的原因：主要是胚胎實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單囊胚移植的選擇策略所造成的。因?yàn)槟壳暗呐咛ダ鋬霾呗院瓦x擇胚胎移植策略均優(yōu)先考慮由可用胚胎發(fā)育形成的優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行單囊胚的移植。這種碎片占＞30%（不清C4）或者D2 天發(fā)育速度過快（D2 卵裂球數(shù)目N≥7）的胚胎形成囊胚的概率通常較低，即使發(fā)育成優(yōu)質(zhì)的囊胚，按照目前的移植策略，并不是首次移植的最佳選擇。

在另外一個(gè)研究中得到了相反的結(jié)局，SILBER［1］根據(jù)第三天評(píng)級(jí)來(lái)研究囊胚的妊娠結(jié)局，得出結(jié)論：D3 胚胎質(zhì)量差胚胎發(fā)育的囊胚與優(yōu)質(zhì)胚胎形成囊胚相比，顯著降低了植入率和臨床妊娠率（39%，73%；P＜0.01；34%，54%；P=0.02）。造成結(jié)果差異的原因可能是不同評(píng)分方法所導(dǎo)致。作者報(bào)道的評(píng)分中，要求是6-8 細(xì)胞、卵裂球均勻、碎片率小于20%的胚胎才可以評(píng)分為優(yōu)質(zhì)胚胎。筆者的評(píng)分方法要求D2 為3～5 細(xì)胞（多為4 細(xì)胞），D3 為7～9 細(xì)胞（多為8 細(xì)胞）；卵裂球均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)大空泡，無(wú)多核現(xiàn)象，碎片占10%～20%。因此，形態(tài)學(xué)評(píng)分作為一種主觀上的評(píng)分方法，可能會(huì)受到廣泛的內(nèi)部和內(nèi)在的影響。URMAN 等研究表明［11］，卵裂期胚胎評(píng)級(jí)可以影響囊胚形成率，而與囊胚的質(zhì)量無(wú)關(guān)。隨著胚胎基因組的激活，基因和代謝缺陷的胚胎將被自然淘汰，所以將卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚階段，可增加胚胎的自我選擇作用。囊胚培養(yǎng)技術(shù)的開展，使4 級(jí)胚胎的利用價(jià)值再次得到重視，這為無(wú)可利用胚胎或可利用胚胎較少患者，提供了最大化利用胚胎的機(jī)會(huì)。BOOSTANFAR 等研究表明［12］，囊胚形成率隨著第3 天胚胎的卵裂球細(xì)胞數(shù)目的增大而增高。KONG 等也認(rèn)為［13］，卵裂球數(shù)目≥6 組的囊胚形成率明顯高于2～5 細(xì)胞的胚胎。本研究將D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)的胚胎根據(jù)卵裂球數(shù)目分組，結(jié)果表明：卵裂球數(shù)目N≥6 與N ＜6，兩組的臨床結(jié)局兩者并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且兩組的優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠率分別為64.52%和66.67%。但是兩組的優(yōu)質(zhì)囊胚率存在顯著差異，分別為79.49%（31/39），35.29%（12/34）（P＜0.05）。由此得出結(jié)論，D3 評(píng)級(jí)為4 級(jí)的卵裂球數(shù)目較多的胚胎，形成優(yōu)質(zhì)囊胚率較高，具有較高的發(fā)育潛能。但是這部分胚胎中的生化妊娠率卻高于N＜6組，分析其原因是由于D2 評(píng)級(jí)為4 級(jí)的胚胎，在D3 評(píng)級(jí)也是4 級(jí)，這部分胚胎的臨床結(jié)局不好導(dǎo)致的N≥6 組數(shù)據(jù)的異常。因此，筆者將N≥6 組中的D2 天評(píng)級(jí)為4 級(jí)胚胎進(jìn)行排除，從表9中可見，Ⅲ（N≥6 且剔除D2為4 級(jí)）的臨床妊娠結(jié)局好于Ⅳ（N ＜6 且剔除D2為4 級(jí)），但是以上數(shù)據(jù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是數(shù)據(jù)量較少的原因，因此接下來(lái)筆者需要擴(kuò)大樣本對(duì)其進(jìn)行深入的研究。分析Ⅲ和Ⅳ兩組優(yōu)質(zhì)囊胚率，可得出兩組的優(yōu)質(zhì)囊胚比例也存在明顯差異。這與DAL CANTO 的研究結(jié)果一致［14］，他們利用time-lapse 培養(yǎng)系統(tǒng)研究2-8 細(xì)胞不同卵裂時(shí)間和囊胚形成、擴(kuò)張及植入的相關(guān)性，結(jié)果表明，具有形成囊胚，擴(kuò)大和植入這樣能力的胚胎，其從2 到8 細(xì)胞階段的卵裂就發(fā)生得越早。數(shù)據(jù)表明具有植入能力的胚胎，其發(fā)育至8 細(xì)胞階段的平均時(shí)間應(yīng)當(dāng)是小于55 h。但是到了D3天（66～68 h），許多的胚胎已經(jīng)進(jìn)入了下一個(gè)分裂周期。這會(huì)導(dǎo)致這部分植入能力較高的胚胎，在D3 進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分時(shí)，由于卵裂球數(shù)目較多（N≥8）而評(píng)級(jí)為3 級(jí)甚至4 級(jí)。因此常規(guī)觀察時(shí)間在第2 d 和第3 d 之間的時(shí)間間隔不適合準(zhǔn)確的胚胎評(píng)價(jià)。

為了進(jìn)一步研究不同評(píng)級(jí)胚胎的遠(yuǎn)期影響，筆者對(duì)出生后嬰兒的身高和體重做了跟蹤隨訪。不同卵裂期評(píng)級(jí)的囊胚進(jìn)行單囊胚移植后，出生嬰兒的身高和體重均無(wú)差異。因此，在進(jìn)行單囊胚移植時(shí)，選擇不同卵裂期評(píng)級(jí)的囊胚對(duì)出生嬰兒并無(wú)影響。胚胎的發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，僅依據(jù)D2 和D3 評(píng)分并不能真實(shí)的反應(yīng)胚胎后續(xù)的發(fā)育潛能。在進(jìn)行單囊胚移植時(shí)，需要首先參考的是囊胚的質(zhì)量，所選囊胚的D2 和D3 的形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)與囊胚的妊娠結(jié)局沒有相關(guān)性。本研究中觀察到，D2 評(píng)分為4 級(jí)的囊胚的臨床妊娠率較低且流產(chǎn)率較高，但是并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而且D2 評(píng)級(jí)為4 級(jí)的樣本量較少，所以需要擴(kuò)大樣本做進(jìn)一步的研究。但是這一結(jié)果也可能與不同的評(píng)分方法有關(guān)，因此結(jié)合time-lapes 對(duì)胚胎的形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，才能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)論。