清腎顆粒對腎纖維化大鼠P-selectin/PSGL-1的干預(yù)作用

陳友雪 ，王億平，金 華，王 東，張 磊

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，安徽 合肥 230031)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一個(gè)重要的世界性健康問題，其病理基礎(chǔ)是腎纖維化。前期研究表明，CKD患者P-選擇素(P-selectin)水平表達(dá)異常，提示P-selectin與腎臟纖維化過程密切相關(guān)[1]。P-selectin的表達(dá)可能成為腎臟病變的標(biāo)志，其與P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)的結(jié)合是啟動(dòng)炎性反應(yīng)和維持炎性狀態(tài)的一個(gè)關(guān)鍵因素[2-3]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察清腎顆粒是否能夠通過抑制P-selectin和PSGL-1的表達(dá)，從而達(dá)到抗5/6腎切除大鼠腎纖維化的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 選取72只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，全部購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0006]。

1.2 藥物與試劑 清腎顆粒由生大黃、白花蛇舌草、丹參、澤瀉等藥物組成。藥材由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房統(tǒng)一進(jìn)貨，每袋顆粒劑10 g，皖藥制字BZ20080011。氯沙坦鉀由默沙東公司生產(chǎn)，每粒50 mg，國藥準(zhǔn)字H20130409。CD62P/P-Selectin抗體、CD162/PSGL-1抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為AG09117573、AD110342。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與分組 除正常組12只之外，其余60只大鼠均按文獻(xiàn)[4]方法復(fù)制5/6腎切除腎纖維化模型。將大鼠禁食12 h，麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，從距左脊肋骨1.5 cm處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上、下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1 min，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整個(gè)右腎，2次共切除5/6腎臟。采用SPSS 17. 0 產(chǎn)生的隨機(jī)號隨機(jī)分為模型組，清腎顆粒高、中、低劑量組，氯沙坦組，每組12只。

2.2 給藥方法 各組動(dòng)物均在模型復(fù)制后第1天開始灌胃，每日1次，每次2 mL。正常組、模型組分別采用等容量溫水灌胃；清腎顆粒低、中、高劑量組分別按每日4.0、8.0、16.0 g/kg(4.0 g/kg為成人臨床等效劑量)給予清腎顆粒水溶液灌胃；氯沙坦組給予氯沙坦鉀混懸液(每日13 mg/kg，近似臨床等效藥量)灌胃。連續(xù)給藥12周。

2.3 標(biāo)本留取 將大鼠麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取出左腎，并將取出的腎組織修剪掉纖維結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗后，將腎組織迅速放入液氮，并置于-70 ℃冰箱中保存，用于提取P-selectin、PSGL-1蛋白及其RNA。

2.4 觀察指標(biāo) Western blot法檢測腎臟組織中P-selectin及PSGL-1的蛋白表達(dá)水平；RT-PCR法檢測腎臟組織中P-selectin、PSGL-1 mRNA表達(dá)水平。引物序列如下：

P-selectin:5′-CTGAGAACTGGGCAGAC-3′，5′-GGTAGCAGGAGCAGGTGTA-3′，220 bp。

PSGL-1: 5′-CTACCAAAAGAGGTCTGTTCATAC-3′，5′-TGTGCAGGGTGAGGTCATC-3′，395 bp。

3 結(jié)果

與正常組比較，模型組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA相對表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，清腎顆粒各劑量組和氯沙坦組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與氯沙坦組比較，清腎顆粒高劑量組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；清腎顆粒各組之間比較，清腎顆粒高劑量組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠腎臟組織中P-selectin和PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯沙坦組比較，△P<0.05；與清腎顆粒高劑量組比較，◇P<0.05

注：1.正常組；2.模型組；3.清腎顆粒高劑量組；4.清腎顆粒中劑量組；5.清腎顆粒低劑量組；6.氯沙坦組

圖1 Western blot法檢測各組大鼠P-selectin、PSGL-1表達(dá)水平

4 討論

腎纖維化是CKD的病理基礎(chǔ)，其過程是不可逆的，而最終發(fā)展結(jié)局是終末期腎臟病，因此如何延緩這一過程是亟待解決的關(guān)鍵問題。相關(guān)文獻(xiàn)表明，腎臟組織炎性病變在腎纖維化發(fā)生及進(jìn)展中起到至關(guān)重要的作用[5]。腎單位毛細(xì)血管參與血漿濾過和再吸收、組織供氧和營養(yǎng)等重要環(huán)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷推動(dòng)慢性腎臟病發(fā)展的進(jìn)程[6]。而P-selectin是炎癥、組織損傷時(shí)重要的黏附分子，可通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附、血小板與白細(xì)胞相互作用，參與炎性反應(yīng)[7]。PSGL-1作為一種重要的炎性分子，主要表達(dá)于各種白細(xì)胞，是目前被發(fā)現(xiàn)的P-selectin中最主要的糖蛋白配體。PSGL-1的作用不但可以促進(jìn)白細(xì)胞的黏附，而且還在激活白細(xì)胞的過程中作為信號分子傳遞信號[8]。內(nèi)皮細(xì)胞上的P-selectin與白細(xì)胞上PSGL-1結(jié)合，可驅(qū)動(dòng)白細(xì)胞在炎癥部位血管內(nèi)皮表面滾動(dòng)減緩，并通過反復(fù)黏附過程，促使白細(xì)胞遷移進(jìn)入炎癥局部，參與腎臟纖維化過程的一系列炎性反應(yīng)，而針對P-selectin及配體的抗黏附干預(yù)，可有效抑制纖維化形成及白細(xì)胞的炎性浸潤。

清腎顆粒為清熱化濕、祛瘀泄?jié)岬闹兴帍?fù)方，其用于慢性腎衰竭濕熱證患者，療效顯著。前期實(shí)驗(yàn)研究[9-12]表明，濕熱證是慢性腎衰竭患者的主要中醫(yī)證候，慢性腎衰竭濕熱證與腎臟炎癥狀態(tài)及高表達(dá)的炎性因子密切相關(guān)；具有清熱化濕祛瘀功效的中藥復(fù)方清腎顆粒能夠顯著降低慢性腎衰竭患者血漿P-selectin水平，發(fā)揮其保護(hù)腎功能、抗腎臟纖維化的作用。

本次研究結(jié)果表明，5/6腎切除大鼠腎組織中P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)，經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組大鼠P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.05)，其中清腎顆粒高劑量組較氯沙坦組顯著降低(P<0.05)，清腎顆粒3個(gè)劑量組中，高劑量組P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表達(dá)水平最低(P<0.05)；結(jié)果提示清腎顆粒能夠降低P-selectin及其配體的蛋白和基因表達(dá)，其作用優(yōu)于氯沙坦，且呈量效關(guān)系。清腎顆粒通過從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯兩個(gè)方面下調(diào)腎組織P-selectin和PSGL-1的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腎臟纖維化作用。