黃瓜突變體庫的構建及表型變異的初步研究

薛紅霞 蔣舉衛(wèi) 李曉麗 宋曉飛 鄭金雙 閆立英 孫成振

(河北科技師范學院園藝科技學院,河北 昌黎 066600)

黃瓜(Cucumis sativus L.)屬葫蘆科甜瓜屬,原產(chǎn)于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū),是世界十大蔬菜作物之一,也是中國重要的經(jīng)濟類蔬菜作物[1]。盡管黃瓜的地理分布十分廣泛,但與同科的甜瓜、南瓜等作物相比,其品種遺傳基礎趨向單一化,變異率僅為3%～8%[2],極大地限制了其育種進程。目前,自然突變、遠緣雜交[3]、組織培養(yǎng)[4]、人工誘變[5]、基因工程[6]已成為種質創(chuàng)新的重要手段,其中以人工誘變較為常見[7]。通常,人工誘變主要包括化學誘變、物理誘變、插入誘變等技術[8]。化學誘變是指利用化學誘變劑對植物材料進行處理,誘發(fā)遺傳物質核酸發(fā)生變異,主要包括核酸堿基類似物、DNA 插入劑和堿基修飾劑3類,其化合物結構具有不穩(wěn)定性[9]。大量研究表明EMS 誘變具有效率高、負作用小、應用廣等優(yōu)勢,是當前構建大規(guī)模飽和突變體庫的理想誘變方法[10-12]。如Chen 等[13]基于細胞懸浮培養(yǎng)的高效甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)誘變體系,獲得了節(jié)間變長的水稻突變體；王瑾等[14]利用EMS 溶液誘變處理抗旱性弱的小麥花藥和幼胚愈傷組織,獲得了13 株抗旱突變體；盧銀[15]采取EMS 誘變種子1 次、EMS 誘變種子2 次及EMS 誘變花蕾結合小孢子培養(yǎng)的方法,構建了含有4 253 個家系及其自交M2種子的大白菜突變體庫。

目前,一些作物已成功構建了飽和的突變體庫,如擬南芥[16]、水稻[17]等,且明確了矮化、抗旱等基因的功能[18],而黃瓜突變體庫的構建及基因功能研究起步較晚,目前大多數(shù)集中在華北型黃瓜突變體庫的構建,如王晶等[19]構建了可穩(wěn)定遺傳的株型、葉色、花器官以及果實等豐富變異類型的長春密刺突變體庫；薛存寶[20]選定1.5%和2.0% EMS 誘變黃瓜種子,獲得了64 個重要表型突變家系；張兵[21]利用1%EMS 誘變處理黃瓜種子22 h,M2獲得了細長果實、短粗果實、簇生葉等突變體。本研究以華南型黃瓜高代自交系6457為試驗材料,通過EMS 誘變的方法構建華南型黃瓜突變體庫,分析華南型黃瓜突變?nèi)后w的表型變異特點,旨在拓寬黃瓜遺傳背景,為黃瓜功能基因組研究和新品種選育提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 華南型黃瓜高代自交系6457,由河北科技師范學院黃瓜課題組提供。

1.1.2 試劑 甲基磺酸乙酯(EMS)購自北京華越洋生物科技有限公司。用于化學誘變劑溶劑配制的化學藥品為常規(guī)無機試劑Na2HPO4和NaH2PO4,購自北京華越洋生物科技有限公司,產(chǎn)品純度為化學純。

取Na2HPO435.82 g、NaH2PO415.605 g,各自配置500 mL 溶液,命名為A、B 液,待試驗時再按61 ∶39配制磷酸緩沖溶液,用NaOH 溶液微調pH 值至7.0[20]。

1.2 試驗方法

1.2.1 EMS 誘變最佳處理條件篩選 分別設置5 個EMS 濃度梯度(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、5 個時間梯度(4、6、8、10、12 h)對黃瓜6457 種子進行處理,其中對照組(CK)均放在蒸餾水中處理相應的時間。每個處理組選取50 粒大小均勻、顆粒飽滿的黃瓜種子,溫湯浸種3 h 后放入10 mL 離心管中,在通風櫥中加入相應濃度的EMS 磷酸緩沖液,室溫搖床上處理相應時間后,用1 mol·L-1Na2S2O3沖洗種子和容器1 次,倒掉,再用0.1 mol·L-1Na2S2O3沖洗3 次,流水沖洗種子2 h,然后放入28℃恒溫箱催芽12 h,催芽結束后將種子播種于營養(yǎng)土∶蛭石為1 ∶1的基質中,統(tǒng)計并分析誘變后的種子發(fā)芽率、成苗率等,篩選EMS 誘變最佳處理條件[19]。

1.2.2 黃瓜突變體庫的構建 2016年8月22日,將2 500 粒顆粒飽滿、大小均勻的黃瓜6457 種子采用選定的最佳誘變條件進行處理,發(fā)芽后定植于河北科技師范學院實驗農(nóng)場。根據(jù)幼苗種植位置,進行編號。將M1植株進行單株自交授粉,并收獲其種子,M1一般不進行選擇淘汰。然后從每個M1種子中選取20粒顆粒飽滿、大小均勻的黃瓜種子作為M2家系,進行催芽育種,待植株三葉一心時每個家系選擇9 株進行定植,定植對照組20 株,最終成活的單株構成黃瓜突變體庫M2群體,其他處理同常規(guī)管理。

參照李錫香等[22]的方法,以野生型黃瓜6457 為對照,對突變體庫M2群體中單株的變異性狀進行調查。主要調查項目為幼苗期子葉及第1 ～第3 片真葉的葉片性狀,初花期的葉片、花器官、莖、株型性狀,結果期的果實果形、果色等相關性狀。

2 結果與分析

2.1 最佳誘變劑量的篩選

由表1 可知,隨著EMS 濃度的增加及處理時間的延長,黃瓜出芽率和成苗率均呈下降趨勢,表明EMS誘變可使誘變當代部分致死。當EMS 處理濃度為2.0%、時間為10 h 時,M1種子發(fā)芽率接近60%,但種子成苗率只有42%。為了保證獲得較大的突變?nèi)后w,同時保證一定的誘變率,最終確定1.5%EMS 處理10 h為最佳誘變處理。

用1.5%EMS 對2 500 粒飽滿的黃瓜6457 種子處理10 h,共有1 666 粒種子發(fā)芽,1 204 株幼苗成活。M1幼苗定植于日光溫室,自交留種。在M1群體的構建中,由于植株的育性極低,僅有221 個單株收到種子,結籽率為18.4%。在M2群體的構建中,共獲得了221 個株系的1 506 個單株,僅548 個單株收到種子,結籽率為36.3%。

表1 不同誘變處理對黃瓜M1 種子出芽率和成苗率的影響Table 1 Effects of mutagenic treatments on germination and survival rate of M1 cucumber seedlings

2.2 黃瓜突變體庫M1 群體性狀變異

2.2.1 幼苗期葉片表型變異分析 野生型黃瓜6457子葉平展,真葉不皺縮(圖1-A、B)。經(jīng)過EMS 處理后,突變體黃瓜表現(xiàn)為發(fā)芽晚、植株矮小、真葉褶皺等性狀(圖1-a)。

圖1 EMS 處理對黃瓜苗期表型的影響Fig.1 Effects of EMS treatment on cucumber seedling phenotype

2.2.2 全生育期植株表型變異分析 對突變體庫M1群體的1 204 株黃瓜植株進行調查,共發(fā)現(xiàn)227 株有明顯變異,主要表現(xiàn)為植株矮化,節(jié)間變短(圖2-A),葉片小且卷曲皺縮(圖2-B),畸形植株(圖2-C),植株生長過程卷須較多(圖2-D),植株部分葉片有雜色(圖2-E),白化、黃化植株(圖2-F、G),果實為嵌合體(圖2-H)。通過對M1自交后代的表型鑒定,發(fā)現(xiàn)葉片皺縮、葉色嵌合的表型變異不能遺傳,可能為EMS 化學藥劑傷害造成的性狀變化。

2.3 黃瓜突變體庫M2 群體性狀變異

由表2 可知,176 個突變單株出現(xiàn)38 個變異性狀,總的單株變異頻率為11.7%,其中在葉、花、果實、植株性狀等的變異株數(shù)分別為77、32、57、10,性狀變異頻率分別為5.1%、2.0%、3.8%、0.8%,分別占總變異性狀數(shù)的43.8%、18.2%、32.4%、5.7%。

2.3.1 M2子葉突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 子葉平展,橢圓形,淺綠色(圖3-A)。M2群體中苗期子葉主要表現(xiàn)為子葉黃化(圖3-B)、子葉白化(圖3-C)、子葉淺綠油亮(圖3-D)、三子葉(圖3-E)、子葉皺縮、卷曲(圖3-F)、子葉畸形(圖3-G)。

2.3.2 M2真葉突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 真葉心形五角,葉緣淺鋸齒,尖端尖,單葉互生,兩面均有刺毛,綠色(圖4-A)。M2群體中變異主要表現(xiàn)為幼苗期生長點黃化,真葉淺黃,植株生長過程中,變黃真葉逐漸恢復綠色(圖4-B)；葉色變深且油綠,葉緣為深鋸齒(圖4-C、D)；葉片卷曲褶皺且內(nèi)卷,葉色深綠(圖4-E)；真葉表現(xiàn)為葉尖端銳尖,波狀葉緣(圖4-F、G)；真葉似心形,有深鋸齒和淺鋸齒之分(圖4-H、Ⅰ)；葉近圓形,葉緣較平滑(圖4-J)。

圖2 M1 群體部分表型變異分析Fig.2 Analysis of partial mutant phenotypes in M1 plants

圖3 M2 子葉突變表型Fig.3 Mutant phenotypes of cotyledon in M2 plants

2.3.3 M2花突變表型變異分析 野生型黃瓜6457為單性花,花冠黃色,花瓣5 ～6 片,花冠裂片寬尖,雌花花萼萼片中等,具有單性結實特性(圖5-A、B、C、J)。M2花器官變異性主要表現(xiàn)為雄花花瓣數(shù)增多,花冠裂片寬圓(圖5-D)；雄花花柄較長(圖5-E)；花冠表現(xiàn)為全裂(圖5-F、G)；花萼萼片突變成綠色的細窄小葉(圖5-H)；兩性花突變體(圖5-Ⅰ)；花瓣顏色變?yōu)闇\黃色(圖5-K)。

表2 M2 誘變?nèi)后w中葉、花、果實、植株性狀等的變異Table 2 Phenotypic variation of leaf, flower, fruit and plant in the M2mutagenesis population

圖4 M2 真葉突變表型Fig.4 Mutant phenotypes of euphylla in M2 pla nt s

2.3.4 M2果實突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 以主蔓結瓜為主,短棒狀,瓜長約25 cm,瓜把鈍圓,瓜色淺綠均勻,瓜面稍顯光澤,不灰暗,微棱,有不太明顯的小瘤(圖6-A、B)。M2群體中變異性狀,主要表現(xiàn)為果柄變短(圖6-C、D)；果柄變長,約為野生型的2 倍(圖6-E、F)；瓜面平滑,無刺瘤,無蠟粉,瓜形似歐洲溫室型(圖6-G、H)；植株長勢弱,突變?yōu)槊艽?刺毛細柔(圖6-Ⅰ、J)；瓜把瓶頸形突變體(圖6-K)；瓜把溜肩形突變體(圖6-L)；有的植株果實變短(圖6-M、N、O、P),果柄朝下,幾乎無刺毛(圖6-M)；瓜長變短約為18 cm,瓜型為短圓筒狀(圖6-N)；瓜長和瓜把都變短,小瘤刺瘤上移(圖6-O)；果實兩端寬圓,瓜把不明顯,瓜型變?yōu)闄E圓形,瓜面平滑無瘤(圖6-P)；突變體瓜把變?yōu)榧氶L型,約9 cm,瓜面有光澤且鮮亮(圖6-Q、R)；瓜長變長,約38 cm(圖6-S)；瓜面棱溝明顯,較淺(圖6-T)；瓜瘤較明顯,瓜面略顯不平狀態(tài)(圖6-U)；刺瘤上移(圖6-Ⅴ)；刺瘤下移(圖6-W)；超級子房突變體(圖6-X)。

圖5 M2 花突變表型Fig.5 Mutant phenotypes of flower in M2 plants

2.3.5 M2株型突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 屬無限生長型,主蔓棱柱形,分枝性弱(圖7-A)。M2中株形變異性狀變異的類型主要為植株無生長點,不能夠正常生長(圖7-B)；植株花打頂(圖7-C)；節(jié)間變短,植株矮小(圖7-D)；主蔓無刺毛(圖7-E)；莖變成圓柱形(圖7-F)；莖變?yōu)楸馄綘?且節(jié)間縮短(圖7-G)。

3 討論

目前EMS 已被廣泛應用于作物誘變育種,且最佳誘變條件的確定對突變體庫的成功構建至關重要[23-26]。本試驗以5 個濃度梯度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)和5 個時間梯度(4、6、8、10、12 h)的組合,根據(jù)誘變后黃瓜6457 種子的發(fā)芽率、成苗率,綜合分析得出EMS 濃度是處理黃瓜種子的關鍵因子[27],最終篩選出1.5%EMS 處理10 h 為誘變處理的最適條件。張兵[21]采用1.0%EMS 對山農(nóng)5 號黃瓜種子進行不同時間誘變處理,綜合考慮突變密度和可遺傳后代,最終確定1.0%EMS 處理22 h 為最佳誘變條件。王晶等[19]利用6 個濃度梯度和5 個時間梯度組合的EMS溶液對長春密刺的黃瓜種子進行處理,綜合分析認為致死率26%～28%為合適的誘變條件,最終確定了1.0%EMS 處理10 h 或1.5%EMS 處理8 h 為最佳誘變條件。薛存寶[20]設置5 個EMS 濃度梯度對黃瓜649 種子進行處理,分析出苗率,最終確定1.5%EMS和2.0%EMS 為最佳誘變條件。本研究篩選的最佳誘變條件與前人研究結果存有一定的差異,推測其可能與黃瓜的基因型有關。

圖7 M2 株型突變表型Fig.7 Mutant phenotypes of plant in M2 plants

本試驗利用1.5%EMS 溶液處理2 500 粒黃瓜6457 種子10 h,獲得由1 204 個單株組成的黃瓜突變體庫M1群體。對植株全生育期的表型進行田間調查,發(fā)現(xiàn)經(jīng)EMS 處理的材料,表現(xiàn)為發(fā)芽慢、植株矮小、真葉褶皺,還發(fā)現(xiàn)一些葉片皺縮、葉色嵌合、植株多卷須、矮化、黃化、白化、畸形、果實嵌合體等變異性狀,這與張兵[21]、朱娜娜[23]、陳宸[28]的研究結果相一致。對M1表型變異的植株進行自交留種,發(fā)現(xiàn)這些表型變化在M2中不能再觀察到,進而推斷M1植株所表現(xiàn)的變異多數(shù)是由化學要害造成的。但對M1群體進行全生育期的初步調查仍具有重要的意義,一方面可以更好地了解誘變效果,另一方面也為M2群體的調查提供一定的依據(jù)和方向。

M1共得到221 份種子,每一份種子作為一個家系,M2共得到含有221 個家系的1 506 個單株的突變體庫,共篩選到176 個突變單株,38 個變異性狀。這些變異性狀主要包括子葉白化、子葉黃化、子葉畸形、三子葉、真葉心形、真葉近圓形、花冠全裂、花萼葉片化、瓜條圓筒狀、瓜條紡錘形、長瓜把、主蔓扁平、矮化植株等。本試驗篩選的長瓜把突變體,在王晶等[19]和張兵[21]所構建的突變體庫均有呈現(xiàn)。本試驗還發(fā)現(xiàn)了一株瓜均無毛、光滑、花冠變小的較特殊的變異植株。本試驗所構建的黃瓜突變體庫,包含多個重要表型變異材料,加快了黃瓜種質創(chuàng)新和新品種選育的進程。

4 結論

本研究利用不同EMS 濃度在不同處理時間誘變黃瓜自交系6457 種子,根據(jù)誘變后種子的發(fā)芽率和成苗率,篩選出1.5%EMS 誘導10 h 為最佳誘變條件,構建了含有221 個M2株系的黃瓜突變體庫。誘變后M1出現(xiàn)皺縮葉、葉片黃化突變體、花打頂、果實嵌合體、矮化植株、畸形植株等變異類型,表型突變頻率達到18.9%；M2植株篩選到176 個突變單株,38 種表型變異,性狀變異集中在子葉、真葉、花器官、果實、植株上,總的表型突變率達11.7%。本研究結果為黃瓜育種和功能基因組學的研究提供了重要的基礎材料。