微小核糖核酸與肺動脈高壓的研究進展

劉一凡 劉迎龍 顧 虹 劉玉華 司 銳 蘇俊武

作者單位：261053 濰坊醫(yī)學院（劉一凡）；首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院-北京市心肺血管疾病研究所 小兒心臟中心（劉迎龍 顧虹 劉玉華司銳 蘇俊武）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種以肺血管阻力進行性增高為主要特征的一組疾病，如果未行有效治療，會引起右心功能不全甚至導致死亡，其發(fā)病機制復雜、影響因素眾多，至今未被清晰闡述。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對PAH的分類，分為特發(fā)性PAH、遺傳相關PAH、藥源（或毒源）性PAH和相關病因所致PAH[1]。據(jù)統(tǒng)計，僅因先天性心臟病而引發(fā)的PAH的患病率為1.6～12.5/10萬[2]。由于其較高的發(fā)病率和致死率，有關PAH防治方面的研究成為了熱點。肺血管重構(gòu)是PAH發(fā)生的重要病理表現(xiàn)之一，也是其疾病發(fā)生過程中不可逆的病理特征。病變主要累及肺小、中動脈，主要由于肺動脈內(nèi)皮細胞（polmnary aortic endothelial cells，PAEC）和肺動脈平滑肌細胞（pulmonary aortic smooth muscle cells，PASMC）功能異常所導致，導致具有特征性的同心圓和叢樣病變形成。不論哪種類型，幾乎有著共同的病理學改變：PAEC增生；肺動脈血管平滑肌細胞增生、遷移、收縮；成纖維細胞激活、增生、遷移；炎癥反應。近些年對于發(fā)病機制的研究不外乎基因、后天影響和環(huán)境因素等幾個方面。有研究表明，內(nèi)皮素、前列腺素和磷酸二酯酶等途徑均與PAH的發(fā)生發(fā)展密切相關，也因此研發(fā)了相應藥物。盡管這些藥物對PAH有一定的效果，但仍未能有效控制疾病發(fā)生過程中諸如細胞增殖、遷移等惡性進程，該病的死亡率仍然很高。在基因水平，針對在肺血管重構(gòu)過程中，控制各組成細胞功能改變的關鍵靶點定位研究可能成為PAH防治方面研究的新熱點。

微小核糖核酸（microRNA）是一種在廣大生物體內(nèi)均有表達的內(nèi)源性非編碼核苷酸序列，通過識別特定信使RNA（mRNA）的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），從抑制翻譯過程或影響轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)物穩(wěn)定性等方面來干擾目的蛋白質(zhì)的合成。迄今為止人類基因庫中約2 500個miRNAs已經(jīng)被報道，這些miRNA與超過60%的人類蛋白質(zhì)的編碼基因相關，在整個細胞活動和人類細胞基因表達的微調(diào)中發(fā)揮關鍵作用。microRNA的調(diào)控作用在多種疾病的發(fā)生過程中已被證實，認為miRNA豐度平衡與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關，而對miRNA表達水平的調(diào)節(jié)可能影響諸如PAH的病理過程。事實上，已經(jīng)有一系列證據(jù)表明，miRNA豐度的良好平衡對于維持肺血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)至關重要，而miRNA水平失衡在PAH的發(fā)病機制中起著關鍵作用[3-4]。本綜述重點關注microRNA在已明確參與PAH病理生理過程的信號通路中的功能，總結(jié)了近些年關于microRNA與PAH方面的研究進展。

1.與肺動脈高壓相關的微小核糖核酸

（1）微小核糖核酸的生物合成及功能：microRNA是一類近年來發(fā)現(xiàn)的長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它存在于高等生物、植物、單細胞生物、甚至病毒當中。哺乳動物的microRNA生成是一系列復雜的過程，始于細胞核，通過兩步主要的酶促反應實現(xiàn)。首先，microRNA的編碼基因在RNA聚合酶II催化下轉(zhuǎn)錄，并且通過“戴帽”和“加尾”（5′端甲基化、3′端多聚腺苷酸環(huán)化）修飾后形成一條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA片段，稱為初級miRNA（pri-miRNA）其莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以被稱為微處理器的蛋白質(zhì)復合物識別。其次，大多數(shù)pri-miRNA在一種名為Drosha的特異性核糖核酸酶和其配體蛋白DGCR8的幫助下切割成為長度大約60個核苷酸、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子，稱為前體miRNA（premiRNA）。這些具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA通過核輸出蛋白exportin5主動轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)[5]，被另一種稱為Dicer的RNase III酶在配體分子Argonaute（Ago2）、HIV-1反式激活應答RNA結(jié)合蛋白（trans-activation response ribonucleic acid binding proteins，TRBP）和/或PKR激酶蛋白激活劑（double-stranded RNA-dependent protein kinase activating protein，PACT）的協(xié)助下，最終催化產(chǎn)生大約22個核苷酸長度的成熟的雙鏈microRNA[5-6]。雙鏈miRNA中通常只有一條鏈參與與RNA誘導的沉默相關復合物（RISC）整合，microRNA“種子區(qū)”（seed region）的2-8個核苷酸與靶基因mRNA3′端的相應序列結(jié)合，如果mRNA與microRNA完全互補配對，mRNA則被降解；如果配對不完全，則microRNA在翻譯水平抑制蛋白的生成。這表明microRNA是在轉(zhuǎn)錄后水平對生物過程進行調(diào)控的。

（2）與PAH相關的microRNA：關于microRNA及其在不同疾病中作用的相關研究不斷增加，尤其在癌癥和心血管疾病領域。事實上，在過去的幾年中，已經(jīng)有研究表明microRNA在心血管系統(tǒng)中表達的不平衡可導致各種心血管疾病的發(fā)生，肺動脈血管壁中的miRNA在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，這些miRNA途徑的失調(diào)參與了PAH的發(fā)病機制[4，8]。

1）微小核糖核酸-21與PAH：因microRNA調(diào)節(jié)多個mRNA靶點，又根據(jù)基因在生物體內(nèi)不同的細胞、組織、器官呈現(xiàn)特意性表達特征，據(jù)此推測microRNA的表達也具有器官、組織和細胞的特異性。miR-21定位于人的17號染色體的跨膜蛋白49（transmembrane protein 49，TMEM49）編碼基因內(nèi)部，該基因有獨立的啟動子區(qū)進行轉(zhuǎn)錄。miR-21作為microRNA龐大家族的一員是進些年研究的熱點，其在心血管疾病中的作用也得到了充分證實。

在缺氧動物模型中，miR-21在小鼠的遠端肺小動脈中表達增加[9]，同樣條件下的PASMCs[9-10]和PAECs[11]中也出現(xiàn)了其表達增強的現(xiàn)象。Sarkar等發(fā)現(xiàn)，缺氧處理人原代PASMCs24 h后，檢測發(fā)現(xiàn)miR-21表達上調(diào)，同時通過靶向下調(diào)程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell deaths 4，PDCD4）、Sprouty 2蛋白（SPRY2）和過氧化物酶體增殖物激活 受 體-α（peroxisome proliferators-activated receptorsα，PPARα）的基因表達，從而使PASMCs增殖與遷移增加、凋亡減少[10，12]，然而抑制miR-21表達可以防止和逆轉(zhuǎn)缺氧誘導的PAH[9]。因此，可以通過評估m(xù)iR-21水平來估計PASMC增殖、遷移以及PAH發(fā)展的程度[10]。在White等的研究中miR-21缺失的的小鼠PAEC中PDCD4/caspase-3軸呈激活狀態(tài)并誘導產(chǎn)生PH。相反，在缺氧和應用SU5416（血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑）模型中，過度表達的miR-21影響了PDCD4的表達從而避免小鼠發(fā)生PAH[13]。Pullamsetti及其同事利用缺氧小鼠和野百合堿誘導大鼠模型，研究了miR-21拮抗劑對PAH的進展和右心功能的影響。在這兩種模型中，抗miR-21均能降低肺動脈的肌化程度降低右心室收縮壓[14]。雖然大量研究已經(jīng)證明了miR-21和PAH之間的聯(lián)系，但PAH中miR-21的功能在不同的動物模型誘導方式、不同的組織細胞中可能不一致。根據(jù)Caruso及其同事報道，miR-21在野百合堿（Monocrotaline，MCT）誘導的PAH的大鼠肺中下調(diào)，但在缺氧誘導的PAH中不下調(diào)[7，10]，而在Parikh及其同事的研究中miR-21的含量在MCT處理的大鼠中出現(xiàn)時間依賴性的變化[7，11]。尚不清楚這種差異是否是由于不同劑量的MCT或miR-21測量過程中不同的標準化方法所致。另外，miR-21的抗PAH作用在缺氧+SU5416（選擇性血管內(nèi)皮生長因子受體（Flk-1/KDR）抑制劑）模型中得以驗證[11，13]，但在單一缺氧模型中miR-21則表現(xiàn)為對PAH形成的促進作用[9]。這種矛盾可能一部分由于兩種誘導方式之間的PAH嚴重程度和組織病理學變化的差異所導致：缺氧+SU5416 PAH模型的病理特征在于PAEC增殖加劇，其更接近地模擬人PAH[11，13]。然而在缺氧PAH模型中，對PAEC增殖影響較小，主要是PASMC增殖相對占優(yōu)勢，因此抑制miR-21可防止PASMC增殖和遷移，從而抑制PAH[15]。這些看似矛盾的結(jié)論可能由于miR-21在參與PAH發(fā)病機制的各種細胞類型中的作用不同。總之，miR-21在PAH中的作用是復雜的，有必要以空間和時間的方式進一步的研究充分闡明miR-21參與PAH的機制。

2）微小核糖核酸-143/145與PAH：miR-143和miR-145在一個多順反子簇中有序排列，受共同的啟動子區(qū)域調(diào)控，并被轉(zhuǎn)錄為一種共同的pri-miRNA[16]，因此常作為一組microRNA加以研究。miR-143/145簇位于小鼠18號染色體[17]或人類染色體5q33的1.7-kb高度保守區(qū)內(nèi)[18]。由于miR-143/145在心臟，血管和內(nèi)臟平滑肌細胞中表達最豐富，因此它被認為是為平滑肌細胞特異性miRNA?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miR-145參與PAH的發(fā)病機制，研究證明暴露于缺氧條件下的野生型小鼠以及PAH患者中miR-145的表達均增加，此外還觀察到miR-145基因敲除小鼠和用miR-145抑制劑處理后的小鼠對缺氧誘導的PAH發(fā)生有顯著的保護作用[20]。

PASMC在各種條件誘導產(chǎn)生的生長因子刺激下細胞表型會從收縮型向增殖型轉(zhuǎn)化，若組織中大量PASMC維持在增殖表型會導致血管增厚、管腔狹窄的發(fā)生。miR-143和miR-145的一些下游靶標已被鑒定，并且miR-143/145已被證明是維持平滑肌細胞收縮表型和功能所必需的[16，21]。例如在大鼠主動脈血管SMC中，miR-145通過抑制KLF5，導致心肌素的誘導激活和平滑肌細胞特征標記物例如α-SMA，鈣調(diào)蛋白和平滑肌肌球蛋白重鏈的表達增加，維持細胞收縮表型[19]，Davis-Dusenbery及其同事還進一步發(fā)現(xiàn)，TGP-β和BMP4是通過分別誘導心肌素表達或心肌素相關轉(zhuǎn)錄因子（myocardin-related transcription factors，MRTFs）的核易位，使pri-miR-143/145轉(zhuǎn)錄增加生成更多的成熟miR-143/145，來抑制KLF4表達和增加收縮基因表達從而維持細胞收縮表型的[22-23]。Courboulin等[24]也發(fā)現(xiàn)了KLP-5在PAH模型中含量增加，并且抑制這種蛋白質(zhì)在MCT誘導的大鼠PAH模型中能提供有益的作用。此外還有研究指出，具有II型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（BMPR2）基因突變的PAH患者在重構(gòu)的肺動脈和復雜病變（同心和叢狀血管病變）中具有較高的miR-145水平，表明miR-145是BMP信令的下游目標并在PAH血管病變中起作用[19]。除了影響PASMC表型，Cheng等人在大鼠頸動脈球囊損傷模型中證明了miR-145與內(nèi)膜新生有關，在損傷血管中使用攜帶腺病毒的miR-145恢復miR-145表達可降低新生內(nèi)膜形成和KLP-5活化[19]。然而，Caruso在研究中還發(fā)現(xiàn)了缺氧處理單獨原代PASMCs和PAECs后miR-145表達并無明顯變化，這說明miR-145的表達在細胞水平和在體水平并不一致[20]。miR-145在PAH發(fā)生過程中在相應細胞中的功能及具體機制仍有待于深入研究。

3）微小核糖核酸-223與PAH：miRNA-223（miR-223）最初被描述為骨髓特異性miRNA，在骨髓譜系的細胞中可見高水平表達，粒細胞顯示最高水平[25-26]，并作為幾種腫瘤過程的生物學標志物[27-29]。有研究顯示，它在神經(jīng)保護中發(fā)揮重要作用[30]，并作為骨骼肌和心肌組織損傷的標志[25，31]。Caruso等[7]曾報道過慢性低氧處理的PAH大鼠肺中發(fā)現(xiàn)miR-223減少的現(xiàn)象。在對PASMC和PAEC生物行為影響的機制方面，Shi等[32]指出，血管內(nèi)皮細胞中的miR-223通過靶向β1整合酶拮抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）介導的細胞增殖、遷移等過程從而抑制血管生成，是一種抗血管生成的miRNA。Meloche等人發(fā)現(xiàn)miR-223在PAH-PASMCs和野百合堿誘導的PAH大鼠的肺中表達出現(xiàn)下調(diào)，并且證明miR-223通過直接抑制PAH-PASMC中的PARP-140（一種DNA修復酶，細胞凋亡中核心成員半胱天冬酶的切割底物，在DNA損傷修復與細胞凋亡中發(fā)揮重要作用）起到抗增殖和促凋亡的作用[33]。近期，Yan等[34]在原代培養(yǎng)PASMC的和PAH大鼠模型體內(nèi)中證實了RhoB是大鼠PASMC中miR-223的直接靶標，這一結(jié)果與先前報道的在人類細胞系中hsa-miR-223靶向結(jié)合RhoB的3′端的結(jié)果非常吻合[35]。同時還進一步證明了miR-223通過在轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控RhoB和MLC2抑制PASMC增殖和遷移從而減輕缺氧引發(fā)的肺血管重構(gòu)和PAH；mir-223表達激活劑使用后，由于缺氧引發(fā)的小、中型肺動脈中層膜增生以及在rPASMC和hPASMC中應力纖維組裝等過程均顯著減少，說明mir-223能拮抗體內(nèi)缺氧引發(fā)的肺動脈壓力升高和遠端小動脈肌化[34]。盡管大多數(shù)證據(jù)證明了mir-223在拮抗血管重構(gòu)中的積極作用，然而，Rangrez等[36]就發(fā)現(xiàn)在主動脈血管平滑肌細胞（vasacular smooth muscle cells，VSMCs）中過度表達miR-223有促進增殖并顯著增強細胞遷移的作用。這些研究結(jié)果啟示我們miR-223的功能可能存在組織特異性。最近，有研究發(fā)現(xiàn)了由heartrelated circRNA-miR223-ARC通路對于抗心肌肥大和心力衰竭的作用，這有可能為miR223與PAH的研究提供新的方向[37]。

2.微小核糖核酸與整合素β蛋白（integrin beta，ITGB）

整合素是一種由非共價連接的α亞基和β亞基組成的跨膜糖蛋白。最初被認為主要參與維持細胞粘附和組織完整性，然而進一步的研究表明，整合素還通過影響細胞活性、增殖、分化、遷移、形態(tài)、極性等方面參與炎癥反應、免疫應答和腫瘤發(fā)生等過程[38-41]。整合素直接或功能性關聯(lián)以下因子，激活下游信號傳導途徑來影響細胞行為：細胞內(nèi)銜接子如p130Cas和Grb2；胞質(zhì)酪氨酸激酶如Src家族（SRCfamily tyrosine kinase，SFK）和粘附斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）；生長因子受體如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）；細胞因子受體如IL-3受體[42]。通過以上途徑整聯(lián)蛋白的信號傳導可以“溝通內(nèi)外”，通過與其配體結(jié)合后將細胞外信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，影響肌動蛋白細胞骨架重排以及相關蛋白（包括細胞因子）的基因表達和轉(zhuǎn)錄以影響細胞過程。然而，計算預測表明，miRNA可以通過調(diào)節(jié)信號傳導通路和功能的來實現(xiàn)對整聯(lián)蛋白表達的調(diào)控。這在其他疾病的研究中已被大量證實，例如，miR-31的過度表達下調(diào)整合素α2，α5，αV和β3，并間接影響乳腺癌細胞中整合素β1的表達，從而抑制癌細胞侵襲并降低轉(zhuǎn)移發(fā)生概率[43]。另外，據(jù)報道m(xù)iR-29b可抑制肝星狀細胞中膠原蛋白I和膠原蛋白II的表達，并降低整合素β1的表達[44]。此外，miR-29抑制肝星狀細胞向肌成纖維細胞樣細胞的轉(zhuǎn)化，暗示miR-29可以作為靶向治療肝纖維化的潛在靶點。除了下調(diào)膠原和整合素β1，在大鼠模型中也證明了miR-29出對鹽敏感的高血壓和腎損傷的保護作用[45]。miR-124在成膠質(zhì)細胞瘤細胞系中的過度表達抑制了腫瘤的遷移和侵襲，伴隨著整合素β1的表達下降[46]。一項研究報道，β3整合素降低VEGF受體2（VEGFR2）的表達，抑制VEGF/VEGFR誘導的血管生成和腫瘤生長，從而調(diào)節(jié)血管生成來影響腫瘤的生長[47]。Anita等提出了，PASMCs中的整合素與細胞外基質(zhì)的相互作用有助于類似PAH等血管重構(gòu)性疾病的進展[48]。在最近的研究中，Daile等證明了，通過整合素αvβ3/FAK/AKT通路破壞抑制骨保護素能減弱肺小鼠的動脈高血壓形成[49]。根據(jù)這些研究，整合素有可能和PAH的許多病理過程產(chǎn)生聯(lián)系。

3.結(jié)語

PAH的病理生理學是異質(zhì)性和多因素的，使得未來治療的進步和生物標志物的發(fā)現(xiàn)具有挑戰(zhàn)性。藥物治療需要安全有效，理想情況下應該在疾病的早期階段使用；然而，為了早期識別，需要使用更具體的生物標志物。miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能特征大大增加了我們對細胞生物學的理解，并且它們無處不在的表達和對不同信號通路的影響使其成為細胞功能的中心調(diào)節(jié)器。一些表達水平與PAH嚴重程度相關的miRNA可用作PAH診斷和預后的生物標志物。此外，一些研究已經(jīng)證明了肺和血漿miRNA水平之間的相關性，使得通過qPCR測量miRNA成為一種簡單、無創(chuàng)和經(jīng)濟的診斷方式。miRNA表達的失調(diào)作為PAH發(fā)病機制中的關鍵事件已經(jīng)得到證實，一些研究表明，通過模擬物或microRNA拮抗劑恢復miRNA表達，可以逆轉(zhuǎn)不同動物模型中的PAH。因此，這些小規(guī)模的翻譯調(diào)控因子為生物標記和治療開辟了新的研究途徑。然而，由于miRNA的結(jié)構(gòu)，數(shù)量和變異性，miRNA qPCR的標準化仍然困難；關于作為潛在治療的miRNA，沒有任何基于PAH miRNA的治療應用于臨床。目前，涉及PAH的miRNA的研究數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長，正如目前熱門研究的參與PAH發(fā)展和右心衰竭的miRNA。將來，miRNA在靶組織中有效的、選擇性遞送技術也是至關重要的，這可能需要新的策略來調(diào)節(jié)基因傳遞系統(tǒng)，并通過使用合適的載體來轉(zhuǎn)運選擇性藥物和核酸。