阿托伐他汀通過TGFβ1/miRNA208a信號抑制擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌膠原蛋白I的表達(dá)

趙明明 張金祝 李海德 尹桂華 姚宗芹 宋 杰 趙 蒙 付存玉

擴(kuò)張型心肌病是一類以心力衰竭、猝死、惡性心律失常為臨床表現(xiàn)的常見心肌病。給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心肌纖維化是促進(jìn)擴(kuò)張型心肌病心功能惡化的關(guān)鍵因素[1]。逆轉(zhuǎn)心肌纖維化可能是治療擴(kuò)張型心肌病的重要靶點(diǎn)，但擴(kuò)張型心肌病心肌組織纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚不清楚。有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGP-β1）/miRNA208a在多種病因所致心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中皆起到重要作用[2]。但該信號通路是否在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化中也起到重要作用，目前尚不清楚。

阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑，具有降脂、抗炎、降低TGP-β1的表達(dá)等作用[3]。本研究擬使用阿托伐他汀作為干預(yù)措施，觀察擴(kuò)心病大鼠心肌組織中miRNA208a、TGP-β1、膠原蛋白I（COL-1）等指標(biāo)，探討阿托伐他汀對擴(kuò)心病大鼠心肌組織纖維化的影響及其機(jī)制，從而為阿托伐他汀在擴(kuò)張型心肌病中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.實驗材料 （1）實驗動物：健康雄性，Wistar大鼠30只，7周齡，體質(zhì)量220～240 g，購自山東省實驗動物中心。隨機(jī)分為正常對照組、擴(kuò)張型心肌病（dilated cardio myopathy，DCM）模型組，阿托伐他汀處理組，每組10只。

（2）主要試劑及儀器：阿霉素（10 mg/瓶，共6瓶）購自北京嘉林藥業(yè)有限公司。兔抗大鼠多克隆抗體、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，阿托伐他汀片（20 mg/片，共7片）由瑞輝公司友情提供。

（3）動物模型制備：采用連續(xù)腹腔注射阿霉素法（2.5 mg·kg-1·w-1）制備擴(kuò)張型心肌病大鼠模型[1]。

（4）正常對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，共6周。模型制備成功后，阿托伐他汀處理組給予（12 mg·kg-1·d-1）灌胃。正常對照組、擴(kuò)張型心肌病模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，共12周。

2.觀察指標(biāo)及方法 （1）大鼠心功能及基本指標(biāo)：實驗12周時，應(yīng)用動物心臟彩超（HRQ-230 A）獲取實驗動物心功能相關(guān)指標(biāo)，稱量體質(zhì)量，2%戊巴比妥鈉針左下腹腔注射充分麻醉后，取出各組大鼠心臟，用0.9%氯化鈉溶液清洗，稱各大鼠心臟質(zhì)量。

（2）HE染色法觀察心肌病理學(xué)變化：4%甲醛溶液固定心肌組織，石蠟包埋，切片。石臘切片依次放入二甲苯，乙醇脫蠟，用蒸餾水浸洗后，蘇木紫染色，0.1%鹽酸乙醇分化；浸泡伊紅液染色，風(fēng)干后中性樹膠封片，鏡檢觀察。

（3）Masson染色觀察心肌組織中膠原纖維的表達(dá)及含量：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水洗；Weigert鐵蘇木精染液染核，1%鹽酸酒精分化，麗春紅酸性品紅染液染色，1%磷鉬酸溶液分化，甩干，苯胺藍(lán)染液復(fù)染，1%冰醋酸沖洗切片，快速水洗后，乙醇脫水，二甲苯透明、風(fēng)干后中性樹膠封片，鏡檢并攝片；隨機(jī)選取5個視野，Olmpus-BX50顯微鏡攝像系統(tǒng)攝像，膠原纖維呈藍(lán)色，肌肉、胞漿呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。用高清晰彩色圖文報告分析系統(tǒng)分析，計算每個視野的心肌膠原面積與心肌總面積比值即心肌膠原容積分?jǐn)?shù)。

（4）RT-PCR檢測心肌組織中TGP-β1、miRNA208a、內(nèi)皮素（ET）、βMHC、COL-1表達(dá)水平：Trizol法提取總RNA，嚴(yán)格按RT-PCR試劑盒說明操作，各檢測指標(biāo)引物序列如下：GAPDH上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下 游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；TGP-β1上 游：5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTG-3′，下 游：5′-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3′；βMHC上 游：5′-TACGATTATGCGTTCTTCTCCC-3′，下 游：5′-TCCTCCCTCTGCTTCTGTTTG-3′；ET上游：5′-TGTGTCTACTTCTGCCACCT-3′，下游：5′-CTGCATGGTACTTTGGGCTC-3′；COL-1上 游：5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下 游5′-GAATCCATCGGTCATGCTCT-3′；U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下 游5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；hsa-miR208a-5p loop primer5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTTTTG-3‘F primer 5′-TGCGCATAAGACGAGCA-3′mircoRNA反義鏈通用引物序列5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃30 s，60℃30 s，40個循環(huán)。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。（RT-PCR儀器型號QuantStudio 6）

（5）Western blot法檢測心肌組織中TGP-β1、ET、βMHC、COL-1表達(dá)水平：石蠟組織切片脫蠟后行抗原修復(fù)封閉，然后分別滴加兔多抗GAPDH抗體（1:1 000稀釋），鼠單抗ET（1:1 000稀釋），鼠單抗βMHC（1:500稀釋），兔多抗TGFβ1（1:1 000稀釋），鼠單抗COL-1（1:1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗去多余一抗后分別滴加封閉液稀釋（1:50 000稀釋）的HRP標(biāo)記羊抗小鼠、羊抗兔二抗。TBST洗去多余二抗后滴加工作液覆上保鮮膜，X光膠片壓片、顯影、定影、沖洗膠片用BandScan分析膠片灰度值。

3.統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用單因素方差分析分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.動物心臟彩超結(jié)果 實驗動物心臟彩超結(jié)果表明，與對照組相比，擴(kuò)心病模型大鼠心臟指數(shù)增加，大鼠LVEF降低，LVEDD明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。阿托伐他汀組與擴(kuò)心病組比，LVEF提高、LVEDD減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 兩組大鼠心臟彩超結(jié)果比較（）

表1 兩組大鼠心臟彩超結(jié)果比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05，與擴(kuò)心病組相比，#P＜0.05

項目 對照組（n=9）擴(kuò)心病組（n=9）阿托伐他汀組（n=9）體質(zhì)量/g 367±15.5 250.5±15.6* 296.1±24.4#心臟指數(shù)/（mg/g） 2.02±0.1 2.89±0.43* 2.28±0.27#LVEDD/mm 6.34±0.39 7.60±0.52* 6.85±0.26#LVESD/mm 3.25±0.38 3.76±0.16* 3.41±0.15#LVEF% 91.3±1.65 74.1±2.78* 78.6±2.55#

2.心臟HE染色結(jié)果 對照組心肌纖維走形正常，排列緊密，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；擴(kuò)心病組心肌纖維走形一致，細(xì)胞間質(zhì)模糊，細(xì)胞肥大、水腫。阿托伐他汀組仍見細(xì)胞肥大、水腫。心肌纖維排列稀疏，走形基本正常（圖1）。

3.Masson染色結(jié)果 對照組心肌間質(zhì)見少量膠原纖維分布，擴(kuò)心病組膠原纖維較對照組明顯增多（P＜0.05），而經(jīng)阿托伐他汀處理后心肌間質(zhì)膠原纖維含量降低（P＜0.05，圖2）。

4.RT-PCR結(jié)果 與對照組相比，擴(kuò)心病組microRNA208a表達(dá)量及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表達(dá)量明顯增加，差異具體統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與擴(kuò)心病組相比，阿托伐他汀大鼠心肌組織中microRNA208a表達(dá)水平及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

5.Western blot結(jié)果 與對照組相比，擴(kuò)心病組TGFβ1、內(nèi)皮素（ET）、βMHC、膠原蛋白1（COL-1）蛋白的表達(dá)量明顯增加，差異具體統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與擴(kuò)心病組相比，阿托伐他汀組大鼠心肌組織中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1蛋白的表達(dá)量降低（P＜0.05）結(jié)果與RT-PCR檢測的上述指標(biāo)的mRNA的表達(dá)水平一致。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示阿托伐他汀可減輕擴(kuò)心病大鼠模型心肌組織中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1的過表達(dá)（圖4）。

圖1 各組大鼠心肌組HE染色（×400）A：對照組；B：擴(kuò)心病組；C：阿托伐他汀組

圖2 各組大鼠心肌組Masson染色（×400）A：對照組；B：擴(kuò)心病組；C：阿托伐他汀組

圖3 各組microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表達(dá)量 A：三組miRNA208a表達(dá)量的比較；B：三組TGFβ1mRNA表達(dá)量的比較；C：三組ET mRNA表達(dá)量的比較；D：三組βMHC mRNA表達(dá)量的比較；E：三組COL1 mRNA表達(dá)量的比較；注：與對照組相比，*P＜0.05，與擴(kuò)心病組相比，#P＜0.05

圖4 各組microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表達(dá)量A：對照組；B：擴(kuò)心病組；C：阿托伐他汀組；注：與對照組相比，*P＜0.05，與擴(kuò)心病組相比，#P＜0.05

討論

心肌纖維化是擴(kuò)張型心肌病的重要病理生理變化。高糖可通過TGP-β1/Smad2信號通路促進(jìn)心肌纖維化，導(dǎo)致心功能下降[5]。抑制該信號通路則可減輕心肌纖維化程度[6]。ERK1/2可通過TGFβ1信號旁路促進(jìn)骨膜素的表達(dá)。而骨膜素是心肌纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7]。TGP-β1可促進(jìn)Rho相關(guān)激酶（ROCK）過表達(dá)，從而抑制BMP-2的表達(dá)，促進(jìn)心肌組織纖維化[8]。除此以外，TGFβ1還可以與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2型受體結(jié)合直接導(dǎo)致纖維組織生成和膠原蛋白表達(dá)增多。減少TGP-β1的表達(dá)可能為一種逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的重要方法。

miRNAs是一類大小約22核苷酸的非編碼RNA，多種miRNA參與了心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。miRNA208a是miRNA208家族一員，由β—MHC基因編碼，特異性表達(dá)于心肌組織。在心肌梗死大鼠模型中，miRNA208a促使心肌纖維化、肥大。降低miRNA208a的表達(dá)，可減輕心肌纖維化的程度[12]。抑制miRNA208a的表達(dá)可減輕高鹽飲食大鼠心肌肥厚及周圍血管纖維化程度[13]。機(jī)械牽張H9C2細(xì)胞可通過TGP-β1刺激miRNA208a的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大及內(nèi)皮素、COL-1生成[14]。miRNA208a主要通過其靶標(biāo)內(nèi)皮素、β-MHC發(fā)揮其致心肌纖維化及心肌細(xì)胞肥大作用。內(nèi)皮素是一種跨膜糖蛋白，與TGFβ1具有共同受體?？烧{(diào)節(jié)TGFβ1在細(xì)胞外基質(zhì)中的合成作用。目前已有研究表明miRNA208a與擴(kuò)張型心肌病患者的LVEF成正相關(guān)，與左心室收縮末期容量指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。是很強(qiáng)的心臟不良事件發(fā)生率及心臟源猝死的重要預(yù)測因子，但其在擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用的具體機(jī)制目前尚不清楚[15]。

本研究應(yīng)用阿霉素制造擴(kuò)張型心肌病大鼠模型，心臟彩超示心臟指數(shù)（mg/g）LVEDD、LVESD均明顯增大。免疫組織化學(xué)進(jìn)一步提示心肌間質(zhì)纖維化程度較正常對照組重。同時我們發(fā)現(xiàn)其心肌組織TGP-β1、miRNA208a、內(nèi)皮素、βMHC、COL-1高表達(dá)。提示TGP-β1/miRNA208a信號通路在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，與COL-1的高表達(dá)密切相關(guān)。因此干預(yù)此信號通路可能降低心肌纖維化程度，從而改善心功能。阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑。有研究表明，阿托伐他汀可通過抗炎作用抑制兔鈣化性主動脈瓣疾病病變發(fā)展進(jìn)程[16]；可降低擴(kuò)張型心肌病患者血清炎癥因子水平[17]。田艷等研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可降低擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織中TGFβ1的表達(dá)，降低心肌纖維化[18]。通過本研究，我們觀察到經(jīng)阿托伐他汀處理后大鼠較擴(kuò)心病組大鼠LVEDD、LVESD縮小，射血分?jǐn)?shù)增高，表示阿托伐他汀具有一定改善擴(kuò)心病心肌重構(gòu)作用。同時通過心肌Masson染色，我們觀察到，經(jīng)阿托伐他汀處理后大鼠心肌組織纖維化程度明顯降低。我們進(jìn)一步證實阿托伐他汀改變了擴(kuò)張型心肌病模型大鼠心肌組織中TGFβ1/miRNA208a信號通路的表達(dá)。我們推測其降低心肌纖維化的左右 與其對該信號的調(diào)節(jié)有關(guān)。其機(jī)制可能與其具有一定的抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明，阿托伐他汀具有一定減輕擴(kuò)心病大鼠心肌纖維的作用，該作用與 可能與其抑制TGFβ1/miRNA208a信號通路，降低COL-1的表達(dá)相關(guān)。但對其具體藥理作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究；阿托伐他汀抗炎、抗氧化作用是否與該途徑有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。