不同耐鹽性菜用大豆與大豆根瘤菌的共生匹配性研究

代重陽(yáng)，孫繼鑫，王 聰

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

根瘤菌是一類(lèi)廣泛生活在土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，根瘤菌根據(jù)其生長(zhǎng)速度可以分為兩個(gè)類(lèi)群：快生型根瘤菌與慢生型根瘤菌，能侵染豆科植物根部誘導(dǎo)固氮根瘤形成，為固氮酶提供適宜的微環(huán)境，從而使大量的分子態(tài)N2被固定轉(zhuǎn)化為銨，為豆科植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)[1]。經(jīng)根瘤菌固定的氮素能提高土壤肥力，并供在茬和下茬作物利用[2]。因此，合理并且充分的利用共生固氮體系可以減少氮肥施用量，從而減少化肥生產(chǎn)對(duì)環(huán)境帶來(lái)的壓力以及化肥過(guò)量使用對(duì)土壤結(jié)構(gòu)的破壞[3-4]。同一根瘤菌能與多種豆科植物實(shí)現(xiàn)共生，具有“廣譜共生”現(xiàn)象[5]。但不同根瘤菌與同品種大豆的共生固氮能力也存在著明顯差異[6-7]。此外，根瘤菌與豆科植物共生固氮還會(huì)受環(huán)境條件的強(qiáng)烈影響。逆境脅迫會(huì)影響豆科植物根瘤的形成、發(fā)育和根瘤的固氮效率[8-9]。李梅等[10]研究NaCl 脅迫對(duì)苜蓿共生結(jié)瘤的影響發(fā)現(xiàn)，鹽濃度≥100 mmol/L時(shí)，隨著濃度的升高，根瘤數(shù)量不斷減少，根瘤不斷變小，同時(shí)固氮區(qū)細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)減少。ABDELWAHAB[11]研究表明，高濃度鹽脅迫會(huì)更大程度地影響根瘤菌數(shù)量和質(zhì)量，較低濃度的鹽脅迫影響更多的是根瘤固氮酶活性、豆血紅蛋白含量和類(lèi)菌體的蛋白質(zhì)含量，同時(shí)，豆科植物-根瘤菌良好的共生關(guān)系也有助于提高植物的耐鹽性。祁娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在非接菌情況下，隨著NaCl濃度的提高，NaCl對(duì)苜蓿的生長(zhǎng)抑制作用增大，而接菌以后，不同菌株均通過(guò)其固氮作用、根瘤菌與苜蓿共生對(duì)其生長(zhǎng)及生理應(yīng)答特性的改變來(lái)提高苜?？果}脅迫的能力。因此，篩選豆科植物-根瘤菌良好共生體系對(duì)生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)“減肥”及提高豆科植物抗鹽脅迫能力均具有重要意義。

菜用大豆，又稱(chēng)毛豆，是在鼓粒盛期至初熟期生育期采青食用的大豆總稱(chēng)。菜用大豆除含有豐富的植物蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分外還含有豐富的VC和VB1等營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[12-13]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，菜用大豆的種植面積逐年增加。然而，隨著設(shè)施栽培面積的大幅度提高及不合理的水肥管理，土壤鹽漬化和次生鹽漬化呈現(xiàn)繼續(xù)擴(kuò)大的趨勢(shì)。鹽脅迫已成為限制包括菜用大豆在內(nèi)的蔬菜設(shè)施栽培的主要逆境因子。

為此，本研究以菜用大豆耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)和鹽敏感品種日本青以及10個(gè)大豆根瘤菌為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行共生匹配性研究，以期篩選出結(jié)瘤固氮能力較強(qiáng)的菜用大豆-根瘤菌共生體系，為豆科植物抗鹽栽培及實(shí)現(xiàn)“減肥”提供參考，為進(jìn)一步研究豆科植物結(jié)瘤固氮及抗鹽機(jī)制提供優(yōu)良材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株品種 NGR234、HH103、B16、N18、USDA110、USDA122、CB1809（購(gòu)自黑龍江省農(nóng)科院微生物研究所）、ACCC15067、AS1.826、AS1.909（購(gòu)自北納生物技術(shù)有限公司）共10株。其中，快生型根瘤菌為NGR234、HH103、B16、N18、ACCC15067；慢生型根瘤菌為USDA110、USDA122、CB1809、AS1.826、AS1.909。

1.1.2 菜用大豆品種 選用耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)和鹽敏感品種日本青（購(gòu)自中科種業(yè)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根瘤菌的培養(yǎng) 菌種活化：在菌種保藏管里，挑一環(huán)根瘤菌，三線(xiàn)平板法劃在固體YMA 培養(yǎng)基上，倒置放入29℃菌種培養(yǎng)箱中，黑暗處理（快生型菌種72 h，慢生型菌種96 h），直至長(zhǎng)出單菌落。

菌種純化：挑一環(huán)活化過(guò)的單菌落根瘤菌，三線(xiàn)平板法劃在固體YMA 培養(yǎng)基上，倒置放入29℃菌種培養(yǎng)箱中，黑暗處理（快生型菌種48 h，慢生型菌種72 h），直至長(zhǎng)出單菌落。

菌懸液制備：挑一環(huán)純化過(guò)的單菌落根瘤菌，接種到液體YMA 培養(yǎng)基中，29℃、180 r/min 振蕩黑暗培養(yǎng)（快生型菌種48 h，慢生型菌種72 h）。

菌懸液濃度測(cè)定：用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的濃度在600 nm 下OD值≈1.0。

1.2.2 菜用大豆種子消毒 挑選種皮無(wú)破損、飽滿(mǎn)度相近的種子，用95 %乙醇沖洗30 s，配置1∶5次氯酸鈉無(wú)菌水溶液浸泡2 min，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗7次，進(jìn)行種子消毒。

1.2.3 雙瓶法栽培 在塑料瓶底部小孔塞入10 cm長(zhǎng)的紗布條，放置于灌有無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液的玻璃瓶上，經(jīng)紗布引流保持上層塑料瓶中的濕潤(rùn)度。將消毒后的菜用大豆種子直播于上層的塑料瓶中，以蛭石為基質(zhì)，每瓶定植1株，每個(gè)菌種種植7 瓶，3次重復(fù)。將雙層瓶隨機(jī)擺放于人工氣候箱內(nèi)。設(shè)置白天光照16 h，光照強(qiáng)度為90～100 μmol/（m2·s），溫度為20～23℃；夜間黑暗8 h，溫度為16～18℃。待菜用大豆兩片真葉展開(kāi)后進(jìn)行接種，每株苗接種1 mL菌液，從接種日起生長(zhǎng)至30d后進(jìn)行測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

結(jié)瘤數(shù)量：分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)組植株結(jié)瘤數(shù)量并記錄。根瘤鮮重：將統(tǒng)計(jì)好的根瘤用吸水紙吸干表面水分，進(jìn)行稱(chēng)重記錄鮮重。固氮酶活性：取新鮮根瘤用乙炔還原法測(cè)定根瘤的固氮酶活性。地上部生物量：將沖洗干凈的植株吸干，置于75℃烘箱中烘干后稱(chēng)其地上部干重。植株全氮：將烘干后的全株粉碎，取粉末用凱氏定氮法測(cè)定植株含氮量。

1.4 綜合值計(jì)算

綜合值：為某一供試菌種各共生固氮指標(biāo)的Z/Z′值之和。其中，Z為根瘤菌-菜用大豆組合的某一共生固氮指標(biāo)值，Z′為所有供試根瘤菌與該菜用大豆品種組合的同一共生固氮指標(biāo)值之和。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS與Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜用大豆-根瘤菌共生組合的地上部生物量

由表1可知，耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)-USDA122組合的地上部生物量與接種USDA110 無(wú)顯著差異，但顯著高于其他共生組合；綠領(lǐng)八號(hào)-NGR234組合的地上部生物量最低，較綠領(lǐng)八號(hào)-USDA122組合降低16%。鹽敏感品種日本青-HH103組合的地上部生物量與接種USDA110 無(wú)顯著差異，但顯著高于其他共生組合；接種B16、CB1809、AS1.909、AS1.826的地上部生物量均較低。表明不同菜用大豆-根瘤菌組合對(duì)菜用大豆的地上部生長(zhǎng)有顯著影響。

2.2 菜用大豆-根瘤菌的共生固氮指標(biāo)

由表2可知，10種根瘤菌都能與耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)共生結(jié)瘤，并且都具有固氮酶活性，說(shuō)明無(wú)論慢生型根瘤菌還是快生型根瘤菌與綠領(lǐng)八號(hào)的匹配組合下，都可以產(chǎn)生有效根瘤。其中接種USDA122后單株平均根瘤數(shù)和根瘤固氮酶活性最高，分別為35.89個(gè)/株和19.87 μmolC2H4/（mg·min），均顯著高于其他共生組合。而接種CB1809的根瘤數(shù)最少，僅為6.33個(gè)/株；接種NGR234的固氮酶活性最低，僅為9.12 μmolC2H4/（mg·min），均顯著低于其他組合。接種USDA122的根瘤鮮重與接種N18、USDA110、AS1.826 無(wú)顯著差異，但顯著高于其他組合。接種USDA122的植株全氮量除與接種HH103后差異不顯著外，均顯著高于其他共生組合。

10種根瘤菌都能與日本青有效結(jié)瘤。接種HH103的根瘤數(shù)、根瘤鮮重、根瘤固氮酶活性及植株全氮量均最高，分別為40.14個(gè)/株、0.38g/株、16.20 μmolC2H4/（mg·min）、23.16g/kg，且顯著高于其他共生組合。接種USDA110的根瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性及植株全氮量與接種N18 無(wú)顯著差異，但顯著高于除HH103 外的其他7個(gè)組合（表2）。上述結(jié)果表明，根瘤菌不同菌種與菜用大豆的共生固氮能力存在顯著差異。

表2 不同菜用大豆-根瘤菌共生組合的結(jié)瘤固氮指標(biāo)

2.3 菜用大豆-根瘤菌共生組合結(jié)瘤固氮綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的建立

由上述試驗(yàn)結(jié)果可看出，不同大豆根瘤菌與同一品種菜用大豆的結(jié)瘤固氮能力存在顯著差異，但同一菌種與同一品種菜用大豆的不同共生固氮指標(biāo)表現(xiàn)不一致，如CB1809與綠領(lǐng)八號(hào)共生組合的結(jié)瘤數(shù)最少，但其根瘤固氮酶活性卻較高；而N18與日本青共生后的結(jié)瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性及植株全氮量均較高，但根瘤鮮重卻較低（表2）。為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)各菌種與兩菜用大豆品種的結(jié)瘤固氮能力，假定各結(jié)瘤固氮指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響相同，用Z/Z′表示各指標(biāo)對(duì)結(jié)瘤固氮的相對(duì)影響能力，各菌種與菜用大豆結(jié)瘤固氮能力的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為該菌種各結(jié)瘤固氮指標(biāo)的Z/Z′值之和，稱(chēng)為綜合值，綜合值越大，則該組合的結(jié)瘤固氮能力越強(qiáng)。

由表3可知，與耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)共生的10種根瘤菌中，USDA122的綜合值最大，為0.77；B16和CB1809的綜合值最小，均為0.29。各菌種與鹽敏感品種日本青共生后，HH103的綜合值最大，為0.62；CB1809的綜合值最小，為0.30。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，綠領(lǐng)八號(hào)和日本青與各菌種共生后對(duì)應(yīng)的綜合值與其地上部生物量分別呈顯著（r=0.645 4）和極顯著（r=0.842 4）正相關(guān)，表明綜合值能夠準(zhǔn)確反映各菜用大豆-根瘤菌共生體系的結(jié)瘤固氮能力。因此，根據(jù)綜合值的大小，各菌種與耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)共生固氮能力由強(qiáng)到弱依次是：USDA122＞AS1.826＞HH103、USDA110 ＞N18 ＞AS1.909 ＞ACCC15067、NGR234＞B16、CB1809，與鹽敏感品種日本青共生固氮能力由強(qiáng)到弱依次是：HH103＞USDA110＞N18＞USDA122、NGR234 ＞AS1.909 ＞B16 ＞ACCC15067、AS1.8＞CB1809。

表3 不同菜用大豆-根瘤菌共生組合的綜合值

3 討論與結(jié)論

豆科植物與根瘤菌共生固氮獲取氮素相比施用氮肥更經(jīng)濟(jì)有效和無(wú)污染，尤其是在可持續(xù)發(fā)展的理念下，發(fā)展菌肥顯得尤為重要，大豆根瘤菌與菜用大豆的匹配性是提高固氮效率的關(guān)鍵，是菌肥應(yīng)用的前提條件[14-16]。伍惠等[17]通過(guò)大豆根瘤菌與不同地區(qū)27個(gè)大豆主栽品種共生匹配性研究發(fā)現(xiàn)，不同大豆根瘤菌之間結(jié)瘤固氮能力存在極顯著差異。馬中雨等[5]的研究認(rèn)為，快生型根瘤菌表現(xiàn)出比慢生型根瘤菌更嚴(yán)格的大豆品種匹配性。冀照君等[18]的研究則發(fā)現(xiàn)中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）及慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）的大豆根瘤菌都能與魯黃一號(hào)有效共生，但中華根瘤菌屬較慢生根瘤菌屬菌株的共生性能要好。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同大豆根瘤菌之間的結(jié)瘤固氮能力存在顯著差異；慢生根瘤菌USDA122與耐鹽品種綠領(lǐng)八號(hào)、快生根瘤菌HH103與鹽敏感品種日本青均有極好的共生匹配性（表3），這與冀照君等[18]的研究結(jié)果不盡相同。上述研究結(jié)果說(shuō)明大豆根瘤菌與大豆品種共生匹配的復(fù)雜性及共生匹配性研究的必要性。

植株生物量是植物體生長(zhǎng)發(fā)育狀況的綜合體現(xiàn)，它與植物體的生理活動(dòng)密切相關(guān)。與根瘤菌共生固氮作為豆科植物重要的生理過(guò)程，其結(jié)瘤固氮能力的強(qiáng)弱也必然與植物生長(zhǎng)及干物質(zhì)積累密切相關(guān)。根瘤數(shù)、根瘤鮮重、根瘤固氮酶活性及植株全氮量作為衡量豆科植物與根瘤菌共生固氮能力的重要指標(biāo)，它們的綜合表現(xiàn)更能準(zhǔn)確反映豆科植物與根瘤菌的結(jié)瘤固氮能力。本研究中引入的綜合值與菜用大豆地上部生物量呈顯著或極顯著正相關(guān)就充分證明了這一點(diǎn)，同時(shí)也表明以綜合值作為菜用大豆與根瘤菌共生匹配性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)是可行的。