綠色熒光蛋白在植物與病原菌互作研究中的應(yīng)用

史志丹，宋培玲，郝麗芬，皇甫海燕，燕孟嬌，楊永青，郭 晨，賈曉清，皇甫九茹，李子欽，張寶輝，陳斐斐

（1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)特泥河農(nóng)牧場，內(nèi)蒙古 特泥河 021024）

病原菌侵染寄主植物從可侵染部位的接觸開始，到在寄主體內(nèi)定殖、擴(kuò)展、進(jìn)而使寄主表現(xiàn)病癥，在這個過程中植物個體也會產(chǎn)生相應(yīng)的抗病或感病反應(yīng)，并且在生理、組織和形態(tài)上產(chǎn)生一系列的變化。一種寄生物能否成為某種植物的病原菌，取決于病原菌能否克服寄主的抗病機(jī)制，如能克服，則病原菌有致病性，寄主植物表現(xiàn)感病，兩者之間具有親和互作關(guān)系。如不能克服，病原菌沒有致病性，寄主植物表現(xiàn)抗病，兩者之間具有非親和性互作關(guān)系。寄主植物與病原菌之間具有非常復(fù)雜的相互作用，涉及植物與病原菌之間的識別、信號傳導(dǎo)及植物防衛(wèi)反應(yīng)激活等事件[1]。因此，研究植物與病原菌的識別方式、親和性或非親和性的互作模式，對揭示植物與病原菌的互作機(jī)制具有重要意義[2]。借助分子標(biāo)記方法，可以示蹤病原菌在寄主中的入侵、定殖和繁殖過程。標(biāo)記病原微生物的方法主要有抗生素抗性基因、lacZ 基因、lux 基因、inaZ 基因、xylE 基因、gus 基因以及gfp 基因[3]。目前，在病原菌與寄主互作的研究中，利用綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記病原菌，對其侵染過程進(jìn)行示蹤是最為有效的細(xì)胞學(xué)方法之一[4]。GFP 作為重要報告基因，具有高靈敏度、穩(wěn)定性好、低細(xì)胞毒害性等特點(diǎn)。1962年，SHIMOMURA 等[5]首次在維多利亞多管發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)GFP，直到1992年P(guān)RASHER 等[6]克隆出GFP的cDNA 全長后，緊接著在1994年CHALFIE 等[7]在原核大腸桿菌和真核秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中成功表達(dá)了具有熒光性的GFP，同時也證明了GFP 在水母中特異組分不存在的條件下熒光也可以正常表達(dá)。同年，HEIM 等[8]提出GFP 生色團(tuán)的發(fā)光機(jī)制，并表明了生色團(tuán)的形成不需要任何酶或輔助因子的參與。此后，GFP 成為一個研究熱點(diǎn)，在多個學(xué)科領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，同時，GFP 作為一種新的報告分子或定位標(biāo)記物在多種細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動物細(xì)胞中得到廣泛應(yīng)用，且修飾后GFP 也作為生物探針被應(yīng)用到試驗(yàn)中。

1 綠色熒光蛋白基因的病原菌轉(zhuǎn)化方法

1973年，MISHRA和TATUM對粗糙鏈孢霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得轉(zhuǎn)化子后，關(guān)于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究迅速發(fā)展起來。用于遺傳轉(zhuǎn)化方法有很多，針對原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法有CaCl2-PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，制備真菌原生質(zhì)體作為感受態(tài)細(xì)胞，在含有一定濃度的質(zhì)粒CaCl2-PEG 緩沖液中，利用電荷間的相互作用力在原生質(zhì)體表面與外源DNA 形成復(fù)合物，原生質(zhì)體通過內(nèi)吞作用將復(fù)合物整合在受體基因組中[9]。電擊轉(zhuǎn)化法是受體細(xì)胞在瞬間高電壓處理下，形成可恢復(fù)的局部電穿孔，使質(zhì)粒DNA 進(jìn)入受體細(xì)胞，在一定時間內(nèi)恢復(fù)正常生理狀態(tài)從而獲得遺傳轉(zhuǎn)化子[10]。限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Restriction enzyme mediated integration，REMI）是將限制性內(nèi)切酶與已經(jīng)線性化的質(zhì)粒在PEG的作用下導(dǎo)入受體細(xì)胞中，染色體DNA 被限制性內(nèi)切酶切開與線性質(zhì)粒連接，從而獲得轉(zhuǎn)化子[11]。針對完整細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化有基因槍轉(zhuǎn)化法，該方法利用高速微彈發(fā)射裝置，將外源DNA 包被在微小的金粒或鎢粒表面射入受體細(xì)胞中，使外源DNA表達(dá)[12]。醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，是利用高濃度Li+或其他一價金屬陽離子（Na+、K+、Rb+等）誘導(dǎo)并增強(qiáng)細(xì)胞滲透性，使其成為感受態(tài)，在PEG 協(xié)助下完成外源DNA的轉(zhuǎn)化[13]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法（ATMT），主要是通過農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒上的T-DNA 區(qū)和vir 區(qū)共同完成。T-DNA區(qū)是能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)宿主基因的區(qū)域，vir 區(qū)參與T-DNA的加工、轉(zhuǎn)移以及整合，小分子酚類和糖類物質(zhì)誘導(dǎo)激發(fā)會促使vir 區(qū)基因表達(dá)，農(nóng)桿菌侵染將T-DNA 轉(zhuǎn)移并整合至真菌基因組中[14]，使目的基因表達(dá)。不同的轉(zhuǎn)化方法在植物和病原菌中皆有應(yīng)用。陳孝仁等[15]利用CaCl2-PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法用GFP首次標(biāo)記了大豆疫霉，觀察了大豆疫霉在大豆上的侵染動態(tài)并利用此報告系統(tǒng)顯微觀察了在抗病和感病大豆品種根部大豆疫霉游動孢子的侵染情況，從細(xì)胞水平上了解了大豆的抗疫病機(jī)制。宿景霞[16]采用電擊轉(zhuǎn)化方法，將含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入溶磷細(xì)菌菌株中觀察其在葡萄根際的存活特征和定殖動態(tài)規(guī)律。張鑫等[17]利用REMI 轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae）轉(zhuǎn)化子庫。基因槍法和醋酸鋰法在真菌上的報道較少[18]。GU 等[19]利用基因槍法研究植物病原真菌分泌蛋白Ps87。醋酸鋰轉(zhuǎn)化法首次在釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）的轉(zhuǎn)化中獲得成功，隨后在鬼傘菌（Coprinus lagopus）和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）等真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中也獲得成功[20]。趙鳳軒[21]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的真菌表達(dá)載體pCH-sGFP 導(dǎo)入到大麗輪枝菌中，研究了轉(zhuǎn)化子在不同抗病類型棉種中侵染過程的差異，此方法在真菌研究中得到了廣泛的應(yīng)用，根據(jù)轉(zhuǎn)化對象的不同使用不同的轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化效率也不相同。

2 綠色熒光蛋白在病原菌侵染過程中的應(yīng)用

綠色熒光蛋白具有多種優(yōu)點(diǎn)使其在研究病原菌侵染過程中廣泛應(yīng)用。GFP對受體細(xì)胞低毒害性，不會影響受體細(xì)胞的正常生長和功能，在紫外光或藍(lán)光的照射激發(fā)下便可觀察到綠色熒光，熒光穩(wěn)定有較強(qiáng)的耐受性，可以方便、快捷地進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測[22]。熒光蛋白標(biāo)記病原菌后，篩選出熒光蛋白穩(wěn)定表達(dá)和致病力無明顯差異的轉(zhuǎn)化子可以接種于不同生育期和不同組織的寄主植物，在不同時間點(diǎn)、不同的組織部位取樣通過熒光或共聚焦顯微鏡直觀地觀察侵染部位的病原菌。自1996年SPELLIG 等成功轉(zhuǎn)化了玉米黑粉菌，隨后GFP 被應(yīng)用在多個種屬的真菌中。SEXTON 等[23]將gfp 基因?qū)牒诿劜。↙eptosphaeria maculans）中，觀察其侵染油菜的過程。陶愷[24]通過綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株的獲得，揭示了大豆疫霉與寄主親和、非親和互作的動態(tài)變化過程。賈娜娜[22]利用ATMT 技術(shù)對梨腐爛病菌進(jìn)行綠色熒光蛋白標(biāo)記，獲得了梨腐爛病菌轉(zhuǎn)化子，并用篩選到的強(qiáng)、弱致病力菌株轉(zhuǎn)化子侵染梨樹組織觀察病原菌在梨樹中的侵染過程。對獲得的病原菌轉(zhuǎn)化子利用分子技術(shù)擴(kuò)增獲得gfp 基因的兩翼序列，分析突變的目的基因及其功能，從而為研究病原菌的致病機(jī)理提供基礎(chǔ)[25]。張鍵[26]構(gòu)建了大麗輪枝菌的T-DNA 突變體庫，分析并研究了T-DNA 插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列以及突變基因的功能，發(fā)現(xiàn)敲除VdOCH1 基因能夠降低病原菌的致病性。姚錦愛等[27]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入到建蘭莖腐病原尖孢鐮刀菌F02 中，并獲得了表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)化子。孫洪寶等[28]利用綠色熒光蛋白作為標(biāo)記，明確了枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖動態(tài)，從組織學(xué)的角度闡釋西瓜與枯萎病菌親和互作和非親和互作的差異。

3 綠色熒光蛋白在定量檢測植物組織中病原物數(shù)量的應(yīng)用

真菌與植物相互作用的研究中，通過研究受感染的宿主植物組織中病原菌生物量對于明確病害的進(jìn)展具有重要意義。目前的研究方法存在一定的局限性。對真菌生物量的定量常通過幾丁質(zhì)和麥角甾醇的含量來檢測。前者是細(xì)胞壁的組成成分，后者是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分。但是，這兩種物質(zhì)存在于多種真菌中，因此這種測定方法不具有物種特異性。病原菌生物量的定量也可以通過測定特定蛋白質(zhì)（DNA 或RNA）的量，但是，這兩種方法比較耗時，且提取出的RNA 容易降解。而綠色熒光蛋白作為一種高效標(biāo)記物有一個優(yōu)點(diǎn)是其熒光強(qiáng)度和gfp的表達(dá)量成正比，MAOR 等[29]指出綠色熒光強(qiáng)度與異源金線菌轉(zhuǎn)化株的菌絲數(shù)量高度相關(guān)，因此可以通過測定熒光強(qiáng)度而定量真菌的生物量。CHEN 等[30]利用改良的GFP標(biāo)記大豆炭疽（Colletotrichum destructivum）和西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare），測定其接種葉片中綠色熒光蛋白的積累量，同時與Northern blot 雜交技術(shù)測定真菌肌動蛋白基因表達(dá)量做對比，結(jié)果表明，熒光量與真菌生長密切相關(guān)，利用GFP標(biāo)記的真菌檢測綠色熒光強(qiáng)度是一種準(zhǔn)確、快速和簡便的方法，可以定量寄主植物細(xì)胞內(nèi)真菌的生長[31]。

4 綠色熒光蛋白在病原菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位中的應(yīng)用

GFP作為一個分子標(biāo)記可以在細(xì)胞的任何區(qū)域進(jìn)行定位，因此，GFP 在真菌亞細(xì)胞的研究和蛋白功能研究中廣泛運(yùn)用。構(gòu)建GFP 融合蛋白是亞細(xì)胞定位中的一種重要手段，亞細(xì)胞定位能明確表達(dá)蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞中出現(xiàn)的部位，將GFP與細(xì)胞器相關(guān)蛋白融合表達(dá)，就可以觀察候選蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜的分布，以及在不同階段的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，這對于研究真菌的有絲分裂、蛋白分泌、菌絲融合等過程具有重要作用[32]。RIEDEL 等[33]通過GFP標(biāo)記的橡樹疫霉菌（Phytophthora ramorum），研究其各個生活史階段營養(yǎng)體的細(xì)胞學(xué)形態(tài)，與未標(biāo)記菌株相比，GFP菌株致病能力明顯變化。AUDREY 等[34]通過將青色熒光蛋白（CFP）、綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、紅色熒光蛋白（mCherry）與已知亞細(xì)胞定位的基因的N 端或C 端相連，構(gòu)建融合表達(dá)載體，對致病疫霉（Phytophthora infestans）體內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、細(xì)胞核以及過氧化物酶體等細(xì)胞器形態(tài)和分布進(jìn)行了研究。郭曉宇等[35]利用熒光蛋白標(biāo)記結(jié)合熒光染色的方法來研究稻瘟病菌有性世代的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，清晰地標(biāo)記了子囊和子囊孢子的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器和存儲物質(zhì)。

5 展望

綠色熒光蛋白廣泛應(yīng)用于植物病害的各個方面，從植物病原菌的檢測、侵染定殖、抗病基因的表達(dá)、抗病轉(zhuǎn)基因植株的篩選及病原菌致病機(jī)理的研究到分子生物學(xué)和生態(tài)學(xué)等方面的應(yīng)用，GFP 都具有其他報告基因不可替代的優(yōu)點(diǎn)。尤其是在研究病原菌與植物互作方面，能夠?qū)崟r明確病原菌的侵染過程。以上僅是GFP 眾多應(yīng)用中的一小部分，隨著GFP 工程的發(fā)展，GFP的應(yīng)用將會更加廣闊。