基于紙基微流控芯片的手持式食品添加劑檢測(cè)儀

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(1.中國計(jì)量大學(xué)光學(xué)與電子科技學(xué)院，杭州 310018；2.浙江清華長三角研究院；國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心，杭州 311231)

1 前言

近年來，因食品添加劑濫用帶來的食品安全問題受到人們的廣泛關(guān)注。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)如質(zhì)譜、色譜等，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但多數(shù)檢測(cè)周期長、程序復(fù)雜，且儀器一般體積龐大、難以攜帶。

紙基微流控芯片[2]技術(shù)正好符合食品安全檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向。該技術(shù)采用紙(濾紙、層析紙及硝酸纖維素膜等廣義上的紙材料)作為芯片制作材料以及生化分析平臺(tái)。芯片系統(tǒng)內(nèi)可集成樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的分析功能。本研究以紙基微流控芯片為核心技術(shù)，開發(fā)了基于超低成本紙基微流控芯片的手持式食品添加劑現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器

FUJI XEROX Phaser 8560DN噴蠟彩色打印機(jī)(日本富士施樂公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；DZF-6050型真空干燥儀(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)DZQ-400/2D真空包裝機(jī)(浙江江南實(shí)業(yè)有限公司)；YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機(jī)(蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司)；whatman?雙圈定性濾紙(杭州沃華濾紙有限公司)。

2.2 試劑

亞硝酸鈉，GR，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；對(duì)氨基苯磺酰胺，AR，北京化學(xué)試劑公司；N-1-萘基-乙二胺鹽酸鹽，AR，天津傲然精細(xì)化工研究所；檸檬酸，AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；間苯三酚(二水合物)，99%，上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉，AR，無錫市佳妮化工有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，sigma公司； 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，High Purity Grade，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝；雙氧水、甲醛標(biāo)準(zhǔn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

檸檬酸溶液(330 mmol.L-1)：稱取6.34 g 檸檬酸溶于水并定容到100 mL容量瓶中。

亞硝酸鈉[3]指示劑1(330 mmol/L檸檬酸鈉和50 mmo/L對(duì)氨基苯磺酰胺)：稱取0.861 g對(duì)氨基苯磺酰胺，用330 mmol/L檸檬酸溶液將其溶解并定容于100 mL容量瓶中，避光保存。 亞硝酸鈉指示劑2(10 mmol/L N-1-萘基-乙二胺鹽酸鹽)：稱取0.13 g N-1-萘基-乙二胺鹽酸鹽溶解并，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。雙氧水[4]指示劑1(1g/L TMB)：準(zhǔn)確稱取20 mg TMB，用2 mL 無水乙醇溶解后，再用檸檬酸緩沖液定容到20 mL，4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

雙氧水指示劑2(10mg/L HRP和0.5g/L PVP)：準(zhǔn)確稱取10 mg HRP和0.5g PVP，用水溶解并定容至1000 mL，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜兹5]指示劑1(0.1mol/L 間苯三酚)：稱取 0.81g 間苯三酚(二水合物)用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，避光保存。 甲醛指示劑2(4mol/L 氫氧化鈉)：稱取 8g 氫氧化鈉用水溶解并定容于50 mL容量瓶中。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(1g/L)：稱取100 mg在115 ℃烘箱中恒重的亞硝酸鈉用水溶解并定容到100 mL容量瓶中。使用時(shí)，將其逐級(jí)稀釋得到1、2.5、5、10、20、30 mg/L一系列濃度梯度溶液。雙氧水標(biāo)準(zhǔn)溶液(30%)：使用時(shí)將雙氧水標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋制備得到0.5、2、5、10、30mg/l一系列濃度梯度溶液。甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100mg/L)：使用時(shí)將甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋得到0.5、1.5、3、6、10、30mg/L一系列濃度梯度溶液。

3 三維紙芯片的設(shè)計(jì)與制作3.1 紙芯片的制作

本研究所用的三維紙芯片由四層紙芯片疊加加工而成。用CAD設(shè)計(jì)芯片的結(jié)構(gòu)圖案，其中，第一層為加樣、試劑固定及顯色層，此層分別為5 μL不同的食品添加劑檢測(cè)試劑2；第二層為試劑固定層，此層分別為5 μL不同的食品添加劑檢測(cè)試劑1；第三層為進(jìn)樣層、第四層為輸水層。將芯片的結(jié)構(gòu)圖案用噴蠟打印機(jī)打印在中速定性濾紙表面，并將濾紙上的每一個(gè)紙芯片切割開來，放入150 ℃烘烤3 min，取出在室溫冷卻，抽真空干燥。

固定好檢測(cè)試劑的紙芯片經(jīng)過如圖1(a)所示折疊，夾入兩層透明塑料膜中間，采用塑封機(jī)，塑封封裝，并在加樣口位置預(yù)先用激光雕刻機(jī)裁切出與加樣口相同直徑大小的圓孔，即得到用于食品非法添加劑檢測(cè)的三維紙芯片，成品如圖1(b)所示。

圖1 檢測(cè)芯片的組裝過程示意圖(a). 試劑在芯片上的固定位置；(b). 用于食品非法添加劑檢測(cè)的三維紙芯片成品

3.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取有代表性的肉類樣本5g，剪碎，加入10mL純凈水，振搖50次，靜置2min以上。

3.3 測(cè)試結(jié)果與分析

(1)材料選擇

考察了流體在快速、中速和慢速whatman?雙圈定性濾紙[6,7]上的流通情況，記錄不同時(shí)間流體流動(dòng)達(dá)到的距離，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行4次，流動(dòng)距離取平均值，快速濾紙的流速最快，中速濾紙和慢速濾紙的流速相當(dāng)，但是快速濾紙和慢速濾紙的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，說明這兩種濾紙的均一性較差。因此，選擇whatman?雙圈中速定性濾紙作為芯片的制作材料。

(2)芯片設(shè)計(jì)制作及穩(wěn)定性測(cè)試

所設(shè)計(jì)的微流控芯片基材為濾紙，包括噴蠟打印區(qū)、3個(gè)檢測(cè)顯色區(qū)、加樣口，外面包有一層塑料膜，其中塑料膜對(duì)應(yīng)加樣口位置開口，其余地方密封，塑料膜加樣口孔徑6mm。實(shí)物尺寸約為45mm×45mm，厚度小于1mm。質(zhì)量約0.8g。

3min后觀察各檢測(cè)區(qū)里的顏色強(qiáng)度，亞硝酸鈉、雙氧水、甲醛檢測(cè)時(shí)批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值均在8%以內(nèi)，穩(wěn)定性較好。

(3)標(biāo)樣測(cè)定

選用亞硝酸鈉、雙氧水、甲醛作為標(biāo)準(zhǔn)樣液。將濃度分別為1、2、5、10、15、20、30 mg/L 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.5、2、5、10、15、20、25mg/L 雙氧水標(biāo)準(zhǔn)溶液，1、2、5、10、15、20、25mg/L甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液加入芯片中，各濃度分別測(cè)4次，自加入溶液時(shí)計(jì)時(shí)，3min后在自制檢測(cè)暗室中用手機(jī)拍照，得到的圖片用Adobe Photoshop CS6處理，芯片檢測(cè)區(qū)的灰度值(4次平均值)與食品添加劑質(zhì)量濃度進(jìn)行擬合，得到如圖2所示結(jié)果。

圖2 檢測(cè)芯片的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(a).亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度之間的擬合曲線，擬合方程為y 1= -3.1852x + 202.87；(b).雙氧水標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度之間的擬合曲線擬合方程為y 2= -3.276x + 207.61；(c).甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度之間的擬合曲線，擬合方程為y3 = -3.9595x + 196.94

3.4 基于智能手機(jī)的手持式比色法檢測(cè)儀

基于智能手機(jī)的手持式比色法檢測(cè)儀其基本結(jié)構(gòu)包括內(nèi)部照明光源及避光外殼。儀器外殼右側(cè)設(shè)有電源開關(guān)，用于控制光源；儀器正面中上部含有蓋子，打開蓋子，正好放進(jìn)手機(jī)；儀器側(cè)面設(shè)有芯片插槽，供紙芯片插入并比色檢測(cè)；儀器下部右上角裝有一透鏡，與手機(jī)攝像頭位置相對(duì)。根據(jù)手機(jī)牌子與型號(hào)，透鏡位置、儀器尺寸適當(dāng)調(diào)準(zhǔn)。儀器內(nèi)部主要結(jié)構(gòu)包括LED光源，正對(duì)芯片放置位置，提供內(nèi)部照明；還包括電池、控制芯片、電路等元件。智能手機(jī)搭載與手機(jī)兼容的檢測(cè)軟件，自動(dòng)通過軟件顯示、保存檢測(cè)結(jié)果。

用噴蠟打印機(jī)打印紅(R)、綠(G)和藍(lán)(B)3種顏色卡片。分別將3種顏色的卡片放入手持式比色法檢測(cè)儀中，配合手機(jī)連續(xù)采集圖片10 次，用Adobe Photoshop CS6 分別處理3種顏色的圖片，同一位置10 次的R、G、B 值如圖4所示。R、G 和B 值10 次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%、0.3%和0.3%，說明自制的手持式比色法檢測(cè)儀能滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的要求。

圖4 手持式比色法檢測(cè)儀的穩(wěn)定性測(cè)試

4 結(jié)論

完成了一次性食品添加劑檢測(cè)紙基微流控芯片的設(shè)計(jì)加工與試劑固定，提出了將檢測(cè)試劑固定于芯片內(nèi)相應(yīng)區(qū)域，互不干擾；固定試劑保持反應(yīng)顯色性能；采用三維結(jié)構(gòu)只需一次進(jìn)樣，即可完成多步分離、純化及檢測(cè)。最終基于微流控芯片在手持式檢測(cè)儀上實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硝酸鹽、雙氧水、甲醛的現(xiàn)場(chǎng)、低成本、快速、便攜、準(zhǔn)確的檢測(cè)。