超高效液相色譜法測(cè)定中華絨螯蟹的膽固醇含量

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，舟山 316021)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹或大閘蟹，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，甲殼綱，十足目，方蟹科，弓腿亞科，絨鰲蟹屬。中華絨螯蟹的生存適應(yīng)能力很強(qiáng)，廣泛分布在北起遼河、南至珠江的淡水水域，是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類，在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)十分重要的地位[1]。近幾年，我國(guó)的河蟹養(yǎng)殖年產(chǎn)量均在60萬(wàn)噸以上，是世界最大養(yǎng)殖國(guó)，年產(chǎn)值逾400億元[2]。河蟹營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，其中脂類是其主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，不但為河蟹生長(zhǎng)提供能量[3]，且對(duì)蟹可食部分營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味起著關(guān)鍵性的作用[4]。

河蟹脂類包括甘油三酯、游離脂肪酸、磷脂和膽固醇等成分，其中，膽固醇是動(dòng)物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅參與形成細(xì)胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D以及甾體激素的原料[5,6]。但是，膽固醇含量過(guò)高易導(dǎo)致高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化，進(jìn)而誘發(fā)一系列心腦血管疾病，所以飲食中膽固醇的攝入量需要控制[7,8]。因此，河蟹是一種膽固醇含量較高的食品，因此，對(duì)其快速準(zhǔn)確定量對(duì)保證人體健康是具有一定意義的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華絨螯蟹，2017年9月取自固城湖、遼河、陽(yáng)澄湖、黃河等產(chǎn)地；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；色譜純甲醇，德國(guó)Merck公司；其他試劑，如無(wú)水乙醇，氫氧化鉀，冰醋酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀ACQUITY UPLC系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；Avanti JXN-30型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；MS-3型圓周振蕩器，德國(guó)IKA公司；HH-S11-6型水浴鍋，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，濃度為1mg/mL，密封后于冰箱中4 ℃下保存?zhèn)溆?。臨用前，用無(wú)水乙醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于外標(biāo)法定量。

1.4 樣品前處理方法

參考Albuquerque等人方法[9]略作修改。稱取中華絨螯蟹1.00 g蟹黃(蟹膏)樣品或3.00 g蟹肉樣品于離心管中，加入15.0mL無(wú)水乙醇和5.0 mL不同濃度的氫氧化鉀溶液(10 M)混勻，渦旋振蕩30 s。隨后，將試樣置于90℃水浴鍋中恒溫水浴0.5h。皂化結(jié)束后，取出離心管冷卻至室溫，用冰醋酸將樣品調(diào)至中性，于5000g條件下離心5 min，取上清液，再用無(wú)水乙醇定容到50.0mL。取1mL定容好的溶液，過(guò)0.22μm濾膜，進(jìn)行UPLC檢測(cè)，采用外標(biāo)法定量。

1.5 UPLC條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm, 2.1 mm × 100 mm)；柱溫：38 ℃；流動(dòng)相：甲醇；流速：0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm，進(jìn)樣量：1.0～10.0μL。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

UPLC測(cè)定膽固醇方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。其余所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)和多重Duncan比較，p< 0.05表示差異顯著，p< 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC進(jìn)樣體積的選擇

本研究的色譜條件參考自GB 5009.128—2016的HPLC條件[10]，考慮到BEH C18柱(長(zhǎng)度100 mm)的柱容量，實(shí)驗(yàn)選用了濃度為50μg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行了進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。在流速0.2 mL/min條件下，當(dāng)進(jìn)樣量體積在5 μL以下時(shí)，呈現(xiàn)較好的對(duì)稱峰。當(dāng)進(jìn)樣量體積超過(guò)5 μL，出現(xiàn)分叉峰。隨后固定進(jìn)樣體積5 μL，選用濃度5、10、25和200 μg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，結(jié)果如圖2所示。在所試濃度下，所有的膽固醇目標(biāo)峰峰形對(duì)稱。本研究結(jié)果與Ahn等人研究相似，該小組在相同色譜柱、流動(dòng)相甲醇/乙醇/水(45/45/10，v/v/v)，流速0.3 mL/min條件下，發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量超過(guò)4 μL，對(duì)稱峰形消失，分叉峰出現(xiàn)[11]。綜上，本研究選用的最優(yōu)進(jìn)樣量為5 μL。

圖1 不同進(jìn)樣體積的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(50 μg/mL)色譜圖

圖2 不同濃度膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣5 μL的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

本研究按1.5色譜條件和優(yōu)化得到的5μL進(jìn)樣量，以膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)6次。按3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)，10倍信噪比計(jì)算方法的定量限(10S/N)，相關(guān)結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在膽固醇濃度范圍5～200 μg/mL內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率平均值為22273，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.79%；截距為13889，RSD為41.7%；確定系數(shù)R2平均值為0.9999，表明線性良好。檢出限(LOD)為0.9μg/mL，定量限(LOQ)為2.0μg/mL，表明可滿足中華絨螯蟹膽固醇的檢測(cè)分析。

表1 UPLC測(cè)定膽固醇的線性度，檢出限和定量限

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

在不同中華絨螯蟹樣品中通過(guò)添加不同濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，同時(shí)相同加標(biāo)濃度樣品重復(fù)6次，通過(guò)RSD評(píng)價(jià)UPLC測(cè)定方法的精密度(表2)。結(jié)果表明，在20、40、50、300mg/100g加標(biāo)水平下，膽固醇在不同中華絨螯蟹樣品的回收率波動(dòng)較小，平均值范圍為80.5～92.6%，結(jié)果準(zhǔn)確度較高。同一中華絨螯蟹樣品回收率的RSD范圍為0.45～3.1%，均小于5%，表明UPLC測(cè)定中華絨螯蟹膽固醇方法的精密度良好。

表2 中華絨螯蟹膽固醇測(cè)定的回收率和精密度

2.4 中華絨螯蟹樣品膽固醇含量分析

按照本研究建立好的UPLC測(cè)定方法，對(duì)中華絨螯蟹不同部位(圖3)及不同產(chǎn)地(圖4)的膽固醇含量進(jìn)行了分析。如圖3所示，中華絨螯蟹的不同部位膽固醇含量具有差異性。其中，蟹黃和蟹膏的膽固醇含量分別為214±57 mg/100g和194±82 mg/100g，兩者之間無(wú)顯著性差異(p> 0.05)，但均極顯著高于肌肉的膽固醇含量(p< 0.01)。此外，中華絨螯蟹雄蟹肌肉(38.9±5.8 mg/100g)與雌蟹肌肉(40.1±5.0 mg/100g)之間的膽固醇含量無(wú)顯著性差異(p> 0.05)。楊志剛等人研究了餌料對(duì)中華絨螯蟹雄蟹可食部分營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝胰腺和性腺所含膽固醇高于肌肉組織[4]。

如圖4所示，不同產(chǎn)地的中華絨螯蟹的膽固醇含量也具有差異性?？傮w上看，產(chǎn)自陽(yáng)澄湖和固城湖的中華絨螯蟹的膽固醇含量分別為154±115 mg/100g和152± 117 mg/100g，稍高于黃河(83.6±55.7mg/100g)和遼河(97.1 ± 67.8mg/100g)，但差異不顯著(p> 0.05)。詳細(xì)來(lái)看，陽(yáng)澄湖中華絨螯蟹蟹肉的膽固醇含量最高，為44.2±5.3 mg/100g，顯著高于其余3組(p< 0.05)，而遼河中華絨螯蟹蟹肉的膽固醇含量是最低的，為34.2±3.8mg/100g，極顯著低于其余三組(p< 0.01)。陽(yáng)澄湖和固城湖樣品的蟹黃及蟹膏的膽固醇總量分別為264±29mg/100g和264 ±28mg/100g，均顯著高于黃河和遼河的中華絨螯蟹樣品(p< 0.05)；黃河中華絨螯蟹的蟹黃及蟹膏膽固醇總量最低，為128 ±47mg/100g，均顯著低于其余產(chǎn)地的樣品(p< 0.05)。綜上，陽(yáng)澄湖和固城湖產(chǎn)地的中華絨螯蟹的膽固醇含量較高，主要體現(xiàn)在蟹黃和蟹膏部位，這可能與生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)。

圖3 中華絨螯蟹不同部位的膽固醇含量

圖4 不同產(chǎn)地中華絨螯蟹的膽固醇含量

3 結(jié)論

本研究首先建立了測(cè)定中華絨螯蟹中膽固醇含量的超高效液相色譜檢測(cè)法，該方法線性優(yōu)良、準(zhǔn)確度和精密度高，可用于快速準(zhǔn)確分析不同產(chǎn)地中華絨螯蟹膽固醇含量。結(jié)果表明，產(chǎn)自陽(yáng)澄湖和固城湖中華絨螯蟹的膽固醇含量高于黃河和遼河產(chǎn)地，差異性主要體現(xiàn)在蟹黃和蟹膏部位，肌肉部位膽固醇含量差異性較小。