改進(jìn)的固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸殘留量

(1.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310017；2.島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司，上海 200052)

草甘膦( Glyphosate，GLY)是一種高效、低毒、廉價(jià)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，廣泛運(yùn)用于全球各個(gè)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[1]。草甘膦在環(huán)境和生物體內(nèi)不斷富集, 通過(guò)食品和飲用水進(jìn)入人體內(nèi), 對(duì)人體造成危害[2]。隨著全球草甘膦使用量不斷增大，其殘留問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注，歐盟和日本作為我國(guó)茶葉出口的兩大重要市場(chǎng)，均對(duì)茶葉制定了極為苛刻的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[3，4]。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定，茶葉中草甘膦限量為1 mg /kg。研究表明，GLY 及其主要降解產(chǎn)物氨甲基膦酸( Aminomethyl phosphonic acid，AMPA) 具有與有機(jī)磷化合物類似的毒理，主要是與膽堿脂酶結(jié)合, 能引起神經(jīng)過(guò)度興奮、運(yùn)動(dòng)失調(diào), 昏迷, 呼吸中樞麻痹, 癱瘓甚至死[5]。新西蘭等國(guó)家對(duì)草甘膦的限量要求即包括GLY 和AMPA 的總和。

由于GLY 和AMPA均為強(qiáng)極性兩性化合物，因其難揮發(fā)而在應(yīng)用于氣相色譜(GC)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)檢測(cè)時(shí)，因氣化需要引入許多物質(zhì)，操作相對(duì)繁瑣，而由于其紫外光區(qū)無(wú)吸收的特點(diǎn)，無(wú)法用帶紫外檢測(cè)器或者二極管陣列檢測(cè)器的液相色譜進(jìn)行檢測(cè)[6-8]。而目前普遍采用的檢測(cè)方法是GLY和AMPA經(jīng)凈化處理后，在硼酸鹽緩沖溶液中經(jīng)9-芴甲基氯甲酸酯( FMOC-Cl)衍生化，形成在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)上響應(yīng)較好的衍生產(chǎn)物GLY-FMOC和AMPA-FMOC[9，10]。

現(xiàn)有行標(biāo)檢測(cè)方法前處理，特別是凈化過(guò)程繁瑣復(fù)雜，耗費(fèi)較多試劑，基質(zhì)干擾大，耗時(shí)費(fèi)力。目前常用的液-液分配萃取-離子交換柱凈化技術(shù)試劑用量大、操作步驟多，尤其在洗脫過(guò)程中選擇不合適的離子交換柱會(huì)造成回收率偏低，給樣品準(zhǔn)確定量造成很大的困難[11-13]。本文對(duì)GLY 和AMPA的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)前處理提取凈化方式進(jìn)行了改進(jìn)，過(guò)程簡(jiǎn)單，方法快速，回收率和重現(xiàn)性較好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津公司高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配Shimadzu LC-30A高效液相色譜儀;Shimadzu LCMS-8050串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀;Mili-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司);MS3旋渦混合器。

草甘膦(GLY)、氨甲基膦酸(AMPA)(純度≥99 %，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，純度≥98%，百靈威公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)Merck公司)；乙酸銨、硼酸鈉、二氯甲烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；WondaSep Glyphosate固相萃取柱(500 mg，6 mL，島津技邇公司)。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：InertSustainBio C18(3μm，2.1 mm×150 mm)；流動(dòng)相：A相為5 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1 %甲酸)，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～6 min，92%～65% A；6～7 min，65%～5% A；7～9 min，5% A；9～9.01 min，5%～92% A；9.01～14 min，92% A。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL；運(yùn)行時(shí)間：14 min。

離子源：電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子檢測(cè)方式(ESI-)；多反應(yīng)檢測(cè)(MRM模式)；接口溫度：300 ℃；離子源電壓：3.5 kV；加熱模塊溫度：400 ℃；DL溫度：250 ℃；干燥氣流速：10 L/min；加熱器流速：10 L/min；校準(zhǔn)方法：質(zhì)量軸自動(dòng)調(diào)諧校正；其他質(zhì)譜分析參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 GLY和AMPA的質(zhì)譜分析參數(shù)

注：*為定量離子對(duì)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密取GLY和AMPA標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg，分別用超純水溶解轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用水定容至10 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(濃度約為1000 mg/L)。分別精密吸取兩種對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適當(dāng)體積于10 mL容量瓶中，用水稀釋定容，配置成1.0、5.0、10、20、50、100 、250 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。

1.4 供試品溶液的制備

提?。簻?zhǔn)確稱取試樣約1 g，于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，旋渦混勻1 min，靜置浸泡1 h，加3 mL二氯甲烷，旋渦混勻1 min，以8000 rpm下離心2 min，取3 mL上清液于15 mL離心管中，加0.9 mL乙腈，混勻，待凈化。

凈化與衍生：將上述待凈化的提取液上樣于已活化好的WondaSep Glyphosate固相萃取柱(依次用5 mL甲醇和5 mL水活化柱子)，取凈化好的流出液780 μL，加200 μL 5 %硼酸溶液和200 μL 1.0 mg/mL(乙腈)FMOC-CL溶液，混勻，室溫衍生過(guò)夜后，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

精密取濃度為1.0 mg/L的GLY和AMPA標(biāo)準(zhǔn)溶液780 μL，加200 μL 5 %硼酸溶液和200 μL 1.0 mg/mL(乙腈)FMOC-CL溶液，混勻，室溫衍生過(guò)夜，將衍生好的兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入進(jìn)樣器，隨流動(dòng)相直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行母離子和子離子掃描。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GLY-FMOC和AMPA-FMOC在負(fù)離子模式下的方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性較正離子模式好，故本方法采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。

在負(fù)離子模式下對(duì)GLY-FMOC和AMPA-FMOC進(jìn)行母離子掃描，掃描范圍為m/z350～450，得到 [M-H]-峰，分別為m/z391.9和m/z333.9。確定GLY-FMOC和AMPA-FMOC母離子之后，調(diào)節(jié)離子源電壓，最終當(dāng)離子源電壓為3.5 kV時(shí)一級(jí)掃描相應(yīng)最高。確定母離子及其條件后，繼續(xù)進(jìn)行子離子掃描，以得到最佳的二級(jí)質(zhì)譜條件，經(jīng)儀器自帶的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)自動(dòng)優(yōu)化程序，得到GLY-FMOC和AMPA-FMOC的二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)(詳見(jiàn)表1)。最終將優(yōu)化后得到的定量定性離子對(duì)、碰撞能力以及Q1和Q3預(yù)四級(jí)偏置電壓作為GLY-FMOC和AMPA-FMOC的MRM掃描參數(shù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本方法先后使用Themo Hypercarb(100*2.1 mm，3 μm)、InertSustain AQ-C18(100*2.1 mm，1.9 μm)、InertSustainBio C18(100*2.1 mm，3 μm)等3種色譜柱進(jìn)行分離比較。采用Themo Hypercarb、InertSustain AQ-C18色譜柱，GLY峰型拖尾嚴(yán)重，而采用InertSustainBio C18色譜柱草甘膦峰型對(duì)稱、尖銳。分析原因是：GLY含有磷酸基團(tuán)，該基團(tuán)會(huì)和色譜柱不銹鋼柱管上殘存的金屬離子結(jié)合形成螯合物，導(dǎo)致峰型拖尾，而InertSustainBio C18色譜柱在技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)，在不銹管柱管和填料之間添加一層Peek內(nèi)襯，隔絕了不銹鋼柱管上殘存金屬離子與目標(biāo)化合物的接觸，從而峰型尖銳、對(duì)稱，適合GLY及其代謝物的分析，具體MRM譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 草甘膦及代謝物MRM譜圖

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了以下3組流動(dòng)相在上述流動(dòng)相梯度條件下的色譜行為：(1)A為乙腈，B為水溶液；(2)A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨溶液；(3)A為乙腈，B為含0.1 %(v/v)甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液。結(jié)果顯示：流動(dòng)相水中加入一定量的乙酸銨有助于離子化，流動(dòng)相2下的目標(biāo)化合物靈敏度明顯比流動(dòng)相1高，但流動(dòng)相1和2的目標(biāo)峰有明顯的拖尾現(xiàn)象(詳見(jiàn)圖2)，所以本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相3的基礎(chǔ)上加入0.1 %的甲酸，既提高了離子化程度，也改善了色譜峰拖尾現(xiàn)象。所以最終將流動(dòng)相3作為檢測(cè)GLY和AMPA的最佳選擇。

圖2 流動(dòng)相1和2的草甘膦及其代謝產(chǎn)物的MRM結(jié)果

2.3 提取和凈化方式的優(yōu)化

由于GLY和AMPA有很強(qiáng)的極性，極易溶于水，一般采用純水、硼酸鹽緩沖液或者NaOH溶液等進(jìn)行提取。本實(shí)驗(yàn)用上述3種提取劑進(jìn)行回收率考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純水的提取效率最高，且樣品經(jīng)硼酸鹽緩沖液和NaOH溶液提取后，提取液不容易過(guò)固相萃取柱，容易引起堵塞。由于GLY和AMPA不溶于有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)在純水的基礎(chǔ)上加入二氯甲烷，可凈化水取液中的脂溶性成分，所以本實(shí)驗(yàn)采用水-二氯甲烷體系來(lái)提取GLY和AMPA，結(jié)果表明兩種目標(biāo)物回收率較好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

又由于GLY和AMPA含有磷酸基團(tuán)(以及羧酸基團(tuán))和氨基堿性基團(tuán)，且極性較大，因此本實(shí)驗(yàn)中采用陰離子交換小柱WondaSep MAX、陽(yáng)離子交換小柱WondaSep MCX、反相模式固相萃取小柱InertSep HLB、對(duì)磷酸基團(tuán)有特定吸附的MonoSpin PBA小柱以及草甘膦專用固相萃取小柱WondaSep Glyphosate，并根據(jù)各小柱的特點(diǎn)及適用條件，對(duì)茶葉中草甘膦及其代謝物進(jìn)行凈化，采用WondaSep Glyphosate小柱凈化，回收率最高，WondaSep MAX小柱次之，MonoSpin PBA小柱最低，具體見(jiàn)圖3。最終選擇草甘膦專用固相萃取小柱WondaSep Glyphosate對(duì)茶葉進(jìn)行凈化。

圖3 不同固相萃取柱凈化的效果比較

2.4 線性關(guān)系、定量限以及重復(fù)性

取1.3中已配置的標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，分別進(jìn)樣5 μL，以定量監(jiān)測(cè)離子對(duì)的離子流中譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見(jiàn)表2。GLY和AMPA在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系較好(r2均大于0.9992)。

取空白樣品1 g，加入適當(dāng)稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按法制備供試品溶液，得信噪比為3和10時(shí)分別為GLY和AMPA的檢測(cè)限(limits of detection，LOD)與定量限(limits of quantification，LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2。

取空白樣品1 g，加入適當(dāng)稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使樣品中GLY和AMPA最終濃度為50 mg/kg，按樣品制備方法重復(fù)制備6份，測(cè)定GLY和AMPA的含量，重現(xiàn)性RSD在0.8 %～1.2 %，重現(xiàn)性較好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 GLY和AMPA的的線性關(guān)系、檢測(cè)限、定量限和重復(fù)性

2.5 方法回收率與精密度

取空白樣品，每份稱取樣品1 g，分別加入適量的混合對(duì)照品溶液，使供試品溶液最終加樣濃度分別為低、中、高3種(分別約為20、50、100 mg/kg)，平行3份，按樣品制備方法制備供試品溶液，檢測(cè)含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。GLY和AMPA的3個(gè)濃度水平的平均回收率為79.4 %～95.2 %，相對(duì)偏差為4.6 %～8.9 %。

以一定濃度的混合對(duì)照品溶液(約為50 μg/L)一日內(nèi)5次重復(fù)進(jìn)樣峰面積的RSD作為日內(nèi)精密度，以上述的混合對(duì)照品溶液3天重復(fù)進(jìn)樣(每天重復(fù)進(jìn)樣3次)峰面積的RSD作為日間精密度，考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。GLY和AMPA的日內(nèi)精密度為2.7 %～3.3 %，日間精密度為1.5 %～2.2 %。

表3 回收率與日內(nèi)以及日間精密度

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)建立的優(yōu)化后的前處理和色譜質(zhì)譜條件完成了杭州市市場(chǎng)監(jiān)管局2017年第二季度開(kāi)展的茶葉監(jiān)督檢查計(jì)劃，對(duì)杭州市市售的60批次茶葉中的GLY和AMAP進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，GLY和AMAP均未檢出。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究建立了一種改進(jìn)的測(cè)定茶葉中GLY和AMAP的固相萃取/HPLC-MS/MS法。樣品經(jīng)水-二氯甲烷體系提取后，經(jīng)WondaSep Glyphosate固相萃取柱凈化，用InertSustainBio C18色譜柱分析，以流動(dòng)相為乙腈和5 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1 %甲酸)梯度洗脫分離。本方法前處理簡(jiǎn)單，分離效果好，干擾少，回收率高，重現(xiàn)性好，可作為茶葉中草甘膦及代謝物的分析確證方法。