煙草類脂物提取及柱色層族組成分離方法研究

(1.陜西中煙工業(yè)有限責任公司，寶雞 721013；2.中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100193；3.中國科學院地質(zhì)與地球物理研究所蘭州油氣資源研究中心，蘭州 730099)

煙草類脂物是煙葉表面物質(zhì)的重要組成部分，化學成份復雜，其中的特征化學成份與煙草特有香氣和吃味品質(zhì)密切相關。因此，針對煙草類脂物中特征化學成分的有效分離并進行研究，對煙葉品質(zhì)評價、配方研究、工藝生產(chǎn)都有十分重要的意義。

目前，煙草類脂物主要通過二氯甲烷或石油醚等溶劑直接萃取抽提[1]。這些方法普遍存在進樣成份復雜、對設備污染較大、譜圖解析干擾多等不足，不能全面系統(tǒng)地反映煙葉類脂物特征化學成分。

本實驗首先通過對比不同方法及試劑的萃取效率，確定煙草類脂物最佳抽取方法，然后通過不同填柱比例確定了最佳填柱方法，實現(xiàn)了對煙草類植物族組成分離。最后用GC/MS進行定性分析，有效獲取大量煙草化學成分信息[2-8]。此方法可以克服傳統(tǒng)分析方法中的許多微量組分由于被主要組分掩蓋而無法檢測的不足，使煙草類脂物中特征化學成分的分析系統(tǒng)化和完整化。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

高中低檔卷煙及煙葉樣品均由陜西中煙工業(yè)有限責任公司提供，樣品通過旋風磨粉碎后過篩，80目在30℃下干燥備用；二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇(Sigma公司)均為色譜純；石油醚(國藥)；硅膠(80～100目)、氧化鋁(100～200目)。

電子天平(賽多利斯ME414S)；ASE快速抽提(DIONEX 200)；超臨界萃取儀(美國Spe-ed)；超聲萃取儀(德國Elma S300H)；旋轉蒸發(fā)儀(步琪R-215)。

6890N-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；HP-5MS毛細管柱(50m×0.25mm×0.25μm，美國J&W公司)。

1.2 方法

1.2.1 煙草類脂物抽提方法(表1)

表1 不同抽提方法條件

準確稱取3g煙草樣品，通過表1方法抽提搜集到的抽提液放置在干燥皿中揮干后稱重得到煙草類脂物的總重量。

1.2.2 柱色層族組成分離方法

本實驗采用濕法填柱，先在柱底部放入高度為1cm脫脂棉(用二氯甲烷抽提過的)，用玻璃棒搗實，加正己烷潤濕。硅膠和氧化鋁用正己烷浸泡過夜，將硅膠和氧化鋁按不同比例填柱，保持溶劑沒過硅膠表面。

(1) 洗脫非極性餾分。取一定體積的抽提物(含200 mg可溶物)上柱，用正己烷沖洗裝上清液的容器3遍，一并倒入，待樣品全部走完后，再用大量的正己烷沖洗，用量控制在300 mL，此時收集到的餾分為非極性餾分，收集完畢后上旋蒸，濃縮到5 mL，轉移至稱量瓶中，干燥稱重，計算非極性餾分的重量。經(jīng)正己烷定容后上GCMS檢測。

(2) 洗脫弱極性餾分。在柱中繼續(xù)加入100mL左右的二氯甲烷，此時收集到的餾分為弱極性餾分，收集完畢后上旋蒸，濃縮到5mL，轉移至稱量瓶中，干燥稱重，計算弱極性餾分的重量。二氯甲烷定溶后上GCMS檢測。

(3) 洗脫強極性餾分。在柱子中繼續(xù)加入200mL左右的甲醇，此時收集到的餾分為強極性餾分，收集完畢后上旋蒸，濃縮到5mL，轉移至稱量瓶中，干燥稱重，計算強極性餾分的重量。甲酯化處理樣品后上GCMS檢測。

色譜柱：J&W公司HP-5MS毛細管柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm)；分流比：10∶1；進樣量：1μL；色譜柱程序升溫：初始溫度80℃，以4℃/min升至295℃，保持20min；

載氣：高純氦氣；載氣流速：1.0mL/min；進樣口溫度：280℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：3.5min；電離方式：EI；離子化能：70eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；掃描方式：Scan模式；掃描范圍：35～500amu。

采用NIST14標準譜庫檢索進行定性。

2 結果與討論

2.1 煙草類脂物抽提方法對比

本實驗著重考察了索式抽提法[9-11]、超聲抽提法[12]、超臨界二氧化碳萃取法[13]以及快速萃取儀ASE[14-16]方法的煙草類脂物抽提效率。選取3種規(guī)格成品樣品及煙葉樣品進行不同方法的類脂物抽提率對比實驗，從表2及表3看出采用不同抽提方法所得抽提率差異較大；不同檔次卷煙產(chǎn)品及煙葉的類脂物抽提率差異也較大，這可能和卷煙中添加的薄片及梗絲等有關。相比較而言，索氏抽提和ASE抽提法抽提率較高，但考慮到ASE快速抽提容易引起樣品熱降解及組分變化，而且ASE抽提法抽提所得到的瀝青質(zhì)比例較高，因此本實驗排除了ASE抽提法，確定最佳抽提方法為索式抽提。

表2 煙草類脂物不同抽提方法抽提率對比

表3 不同抽提方法所得煙草類脂物族組成特征

注：①所有類脂物均采用硅膠∶氧化鋁=3∶1的柱填料進行分離。②所用樣品為煙葉。

2.2 不同有機溶劑抽提率對比

表4 不同溶劑對煙草類脂物抽提率對比

注：①均采用索式抽提方法，溶劑用量450mL。

對比了3種有機試劑的萃取效率。如表4所示，通過不同萃取溶劑的對比發(fā)現(xiàn)，3氯甲烷對樣品的類脂物抽提效率更高，因此本實驗確定抽提溶劑為三氯甲烷。

2.3 柱色層族組成分離方法

2.3.1 不同填料比例族組成比對

對比了不同填料比例的層析柱對煙草樣品的分析效果，從類脂物不同比例柱層析分離的結果看(圖1)，它們的族組成成分基本相似。但是通過對比各餾分的TIC圖可知(圖2～圖4)，硅膠∶氧化鋁為3∶2時，類脂物特征成分出峰更全，且通過表5～表7可以看出，各族組成化學成分能夠?qū)崿F(xiàn)很好的分離效果，且可以避免其他填料比例分離不充分引起的族組成混亂。

圖1 類脂物不同填料比例柱層析分離效果

序號保留時間分子式分子量名稱118.786C16H34226正十六烷221.516C17H36240正十七烷321.678C19H40268姥鮫烷424.143C18H38254正十八烷524.382C20H42282植烷625.32C20H38278新植二烯725.779C20H38278新植二烯異構825.883C20H38278新植二烯異構926.2C20H38278新植二烯異構1026.478C20H38278新植二烯異構1126.646C19H40268正十九烷1228.282C20H36292烷基呋喃1329.046C20H42282正二十烷1431.342C21H44296正二十一烷1533.548C22H46310正二十二烷1635.663C23H48324正二十三烷1737.701C24H50338正二十四烷1839.667C25H52352正二十五烷1941.55C26H54366正二十六烷2042.701C27H563802-甲基-二十六烷(異構二十七烷)2142.876C27H563803-甲基-二十六烷(反異構二十七烷)2243.458C27H56380正二十七烷2344.48C28H583942-甲基-二十七烷(異構二十八烷)2444.661C28H583943-甲基-二十七烷(反異構二十八烷)2545.133C28H58394正二十八烷2646.214C29H604082-甲基-二十八烷(異構二十九烷)2746.382C29H604083-甲基-二十八烷(反異構二十九烷)2846.899C29H60408正二十九烷2947.876C30H624222-甲基-二十九烷(異構三十烷)3048.109C30H624223-甲基-二十九烷(反異構三十烷)3148.497C30H62422正三十烷3249.564C31H644362-甲基-三十烷(異構三十一烷)3349.7C31H644363-甲基-三十烷(反異構三十一烷)3450.211C31H64436正三十一烷

續(xù)表5

圖3 弱極性餾分色譜(TIC)圖

序號保留時間分子式分子量化合物名稱123.315C13H12O2200三甲基-苯蓖224.104C20H42O228直醇325.300C18H36O268植烯425.572C18H36O268降姥姣烷-2-酮527.299C20H32272植五烯627.396C20H32272植五烯異構

續(xù)表6

續(xù)表6

圖4 強極性餾分色譜(TIC)圖

續(xù)表7

續(xù)表7

煙草類植物的結構、細胞、纖維及超大分子有機質(zhì)等組分在生產(chǎn)過程中并未遭到破壞，所以溶劑法抽提出的類脂物只是煙草中的游離有機質(zhì)。極性餾分由圖1、圖3及表7可以看出是類脂物的主要餾分，其中又以脂肪酸為最高成分同時檢測出甾醇(酮)；瀝青質(zhì)中主要有蛋白質(zhì)、多糖聚糖、氨基酸等GC-MS無法分析的大分子化合物在類脂物中相對含量是僅次于極性化合物的餾分；非極性餾分(飽和烴)中主要成分是烷烴和新植二烯系列，烷烴系列主要存在于植物表層的植物蠟中。許多長鏈脂肪族有機物(脂肪酮、脂肪醇、脂肪酸及其酯等)的鏈斷裂，成為這些烷烴的重要來源。但由于煙葉和卷煙絲還未經(jīng)歷較強烈的熱作用或演化這樣，所以鏈斷裂過程較弱，因而本實驗研究樣品的類脂物中烷烴含量很低。新植二烯(含植物呋喃)系列是植物葉綠素α側鏈-植烯醇的斷裂衍生產(chǎn)物，在類脂物中含量也很低。弱極性餾分中主要有煙草中脂肪酸酯、含羰基和羥基化合物、甾類、維他命E、維他命K、細菌代謝物角鯊烯及胡蘿卜素、番茄紅素的衍生物等化合物，上述物質(zhì)在煙草中均屬于微量成分。通過索式抽提及族組成分離，本實驗能夠有效檢測出174種煙草類脂物化學特征成分，其中非極性餾分46種，弱極性餾分57種，強極性餾分71種。

3 結論

本實驗首先通過對比不同方法及溶劑的萃取效率，確定煙草類脂物最佳萃取方法及溶劑種類，然后通過不同填柱比例對比確定了最佳填柱方法，實現(xiàn)了對煙草類脂物的萃取及族組成分離，最后利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法進行分析。結果表明，煙草類脂物萃取最佳方法為索式抽提法，最佳萃取溶劑為三氯甲烷，柱色層填柱最佳比例為硅膠∶氧化鋁=3∶2。通過本方法能夠有效檢測出174種煙草類脂物化學特征成分，其中非極性餾分46種，弱極性餾分57種，強極性餾分71種，使煙草中類脂化學特征成分的分析系統(tǒng)化和完整化可以更有效的檢測類脂物中微量組分。