毛細(xì)胞白血病相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記研究進(jìn)展

張海英綜述，白 海審校

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院血液科/全軍血液病中心，蘭州 730050)

毛細(xì)胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)是一種少見類型的白血病，病情進(jìn)展緩慢，世界衛(wèi)生組織(WHO)分類歸于B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，亞洲人發(fā)病率明顯低于歐美人，國外其發(fā)病占白血病的2%～3%，國內(nèi)占0.58%[1-2]。目前病因仍不清楚，有研究報(bào)道與自身免疫疾病有一定關(guān)系，如血管炎(特別是動(dòng)脈炎結(jié)節(jié))，另外許多病例的發(fā)生呈現(xiàn)家族相關(guān)性，但具體原因不明[3]。近年來，分子和細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展對HCL的診斷、治療和預(yù)后的評判起到巨大的推動(dòng)作用。研究發(fā)現(xiàn)一些重要的預(yù)后指標(biāo)，如BRAF基因和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因的突變狀況及CD38的過度表達(dá)、染色體畸變等，有助于判斷HCL的預(yù)后。為此，本文將對這些指標(biāo)進(jìn)行綜述，以期指導(dǎo)HCL的預(yù)后判斷和治療。

1 HCL的免疫學(xué)標(biāo)記

目前WHO將HCL分為兩種臨床類型:經(jīng)典型HCL(classic hairy cell leukemia，HCLc)和變異型HCL(hairy cell leukemia variant,HCLv)。毛細(xì)胞具有成熟B淋巴細(xì)胞的免疫表型，表達(dá) CD19、CD20、CD22、CD79a、SmIg，不表達(dá)CD21、CD23、CD79b，特異性高表達(dá)CD25、CD103和CD11c[4]。CD103對HCL有很高的敏感性和特異性，如果與其他全B淋巴細(xì)胞標(biāo)志共表達(dá)，強(qiáng)烈提示HCL。HCLv除表達(dá)成熟B淋巴細(xì)胞免疫標(biāo)志CDl9、CD20、CD22和FMC-7外，還表達(dá)CDllc，其中26%弱表達(dá)CD10，5%弱表達(dá)CD5，不表達(dá)CD25、CD103[5]。故強(qiáng)表達(dá)CD25、CD11c和CD103，再結(jié)合典型的形態(tài)學(xué)特征是鑒別HCLc與其他B系白血病的標(biāo)志。

CD38是與白細(xì)胞活化相關(guān)的抗原，是促使B淋巴細(xì)胞活化和增殖的Ⅱ類跨膜糖蛋白。CD38可以提高HCL細(xì)胞的生存率，促進(jìn)其增殖。HCL患者細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子RhoH低表達(dá)，在小鼠模型中RhoH的上調(diào)可以抑制HCL的發(fā)生，CD38被證實(shí)是依賴于RhoH低表達(dá)的蛋白[6]。PORET等[7]研究發(fā)現(xiàn)，51例HCL患者中18例為CD38陽性，敲除CD38基因可以增加腫瘤細(xì)胞凋亡，持續(xù)性抑制內(nèi)皮細(xì)胞，提高機(jī)體抗腫瘤能力。因此，CD38可能是預(yù)防和治療HCL的新靶點(diǎn)。

CORTAZAR等[8]對500例具有特異性抗膜聯(lián)蛋白A1(ANXA1)抗體的B淋巴細(xì)胞腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，結(jié)果表明HCLc中存在ANXA1特異性表達(dá)，而在HCLv和其他類型B淋巴細(xì)胞腫瘤中均不表達(dá)。因此，ANXA1可作為鑒別HCLc和其他類型B淋巴細(xì)胞腫瘤及HCLv的新指標(biāo)。有研究認(rèn)為，ANXA1可能是糖皮質(zhì)激素在炎性反應(yīng)中的一種中間產(chǎn)物，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞吞噬細(xì)菌和乳膠顆粒有關(guān)。ANXA1的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測將會(huì)成為HCL診斷的重要依據(jù)[9-10]。

2 HCL的分子生物學(xué)標(biāo)記

2.1BRAF基因V600E突變 近年來研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路在HCL發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，而BRAF基因編碼的絲/蘇氨酸蛋白激酶(BRAF蛋白)正是該通路的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[11]。BRAF基因突變可引起上述通路持續(xù)失控的激活，導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖、分化及腫瘤形成。因此，BRAF基因在HCL中的作用日益受到關(guān)注，其生物學(xué)行為及其臨床意義成為近年來的研究熱點(diǎn)[12]。

TIACCI等[13]采用全外顯子組測序的方法，對47例HCL患者的樣品進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)所有樣品均存在BRAF V600E突變。而該研究檢測的195例患有其他外周B淋巴細(xì)胞腫瘤或白血病的患者均不攜帶BRAF V600E突變，包括38例脾邊緣帶淋巴瘤及分類不明的脾淋巴瘤或白血病的患者。ITAMURA等[14]也在所有受檢的經(jīng)典HCL樣本中檢測到BRAF V600E突變，同時(shí)，他們還在伴有免疫學(xué)變化(CD25-、CD10+、CD123-)的形態(tài)學(xué)經(jīng)典HCL患者中觀察到BRAF V600E突變。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)BRAF突變存在于HCL患者的造血干細(xì)胞中[15]。此外，BRAF V600E突變在整個(gè)疾病過程中都非常穩(wěn)定，包括在初診后甚至數(shù)十年后多次復(fù)發(fā)。這些發(fā)現(xiàn)均證實(shí)BRAF V600E突變是HCL的分子標(biāo)志。HCLv和HCLc的IGHV4-34突變型中是不存在BRAF V600E突變的[16]，而在BRAF V600E突變陰性的HCL患者中檢測到11號(hào)外顯子的兩個(gè)新突變，提示可以在V600E陰性的病例中篩選11號(hào)外顯子[17]。這一發(fā)現(xiàn)或?qū)CL的發(fā)病機(jī)理、診斷及靶向治療研究具有啟發(fā)意義。

鑒于RAS和BRAF在惡性腫瘤發(fā)展中的重要性，已經(jīng)研制了針對BRAF的抑制劑。在體外研究中，證明BRAF抑制劑可以促進(jìn)HCL細(xì)胞凋亡[18]。DIETRICH等[19]在難治性HCL患者中使用威羅菲尼，主要結(jié)合BRAF分子并抑制絲裂原激活蛋白激酶(MEK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化和細(xì)胞增殖，證實(shí)了突變型BRAF可作為HCL的治療靶標(biāo)。

2.2微小RNA 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類大小為20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA。近年研究表明，miRNAs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，某些miRNAs在腫瘤中呈特異性表達(dá)[20-21]。BRAF突變可能導(dǎo)致幾種對致癌基因具有調(diào)控作用的miRNAs表達(dá)的改變，近年來，miRNAs和BRAF突變與包括乳頭狀甲狀腺癌在內(nèi)的腫瘤之間的關(guān)系已經(jīng)得到確定[22]。KITAGAWA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常或其他的惡性B淋巴細(xì)胞，HCL中miRNA-221/-222家族、-22、-24、27a和Let-7b均高表達(dá)。他們還發(fā)現(xiàn)HCL中miRNA-221/-222過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期依賴性激酶阻滯基因1B(CDKN1B，又稱p27/Kip1)表達(dá)水平降低，后者是這些miRNAs的直接靶蛋白。鑒于BRAF突變與PTC中miRNA-221/-222的關(guān)系，HCL中miRNA-221/-222的過表達(dá)調(diào)控HCL的MAPK信號(hào)通路，并且與BRAF突變有關(guān)[24]。在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中，miR-22可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，并可上調(diào)Cyclin D2 (CCND2)和MAPK1基因的水平[25]。因此，作者認(rèn)為miRNA-22可能對HCL中MAPK信號(hào)通路具有調(diào)控作用，miRNAs與HCL的疾病進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)，對HCL特異性miRNAs及其與MAPK信號(hào)通路關(guān)系的研究對于HCL的發(fā)病機(jī)制、診斷和靶向治療具有啟示作用。

2.3CDKN1B基因 CDKN1B基因是調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)基因。在細(xì)胞周期中，通過與cyclin-cdk復(fù)合物結(jié)合抑制Rb蛋白磷酸化，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，因而被認(rèn)為是抑癌基因[26]。

國外研究提示在多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)了p27的低水平表達(dá)，包括口腔鱗癌、乳腺癌、前列腺癌等。p27/Kip1低表達(dá)與人類腫瘤治療效果差、侵襲、惡性預(yù)后、腫瘤分級及進(jìn)展都有關(guān)系。最新研究表明，CDKN1B基因也可在其他惡性血液病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，包括T幼稚淋巴細(xì)胞白血病(T-PLL)、急性髓細(xì)胞白血病(AML)和淋巴瘤等[27-28]。

DIETRICH等[29]采用全外顯子測序的方法對81例HCL患者進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)13例患者存在突變，并且其中11例是克隆性突變，提示CDKN1B基因突變在HCL的生物學(xué)和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。在HCL中，所有患者p27蛋白表達(dá)缺失或減弱，提示了基因突變以外CDKN1B基因沉默的其他機(jī)制。因此，通過基因突變或由BRAF-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路本身誘導(dǎo)p27蛋白活性下調(diào)，可促進(jìn)BRAF突變驅(qū)動(dòng)的HCL克隆擴(kuò)增。而在白血病及其他惡性腫瘤中，CDKN1B基因突變是很罕見的，并且與BRAF V600E不共存。

2.4免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IGHV)基因突變 研究發(fā)現(xiàn)，90%左右的HCL B淋巴細(xì)胞存在IGH突變。IGHV突變情況對HCL的預(yù)后具有重要的意義?；贗GHV突變情況，HCL患者的預(yù)后可分為兩個(gè)亞型:突變型HCL(>2%突變)和野生型HCL(≤2%突變)。野生型HCL患者的總生存時(shí)間(OS)少于突變型HCL[30]。

據(jù)報(bào)道，HCLc及HCLv患者表達(dá)IGHV4-34時(shí)的預(yù)后特別差[31]。82例患者中，IGHV4-34(+)和IGHV4-34(-)患者的OS分別為4.8年和26年(P<0.000 1)。當(dāng)診斷為HCLc時(shí)，IGHV4-34仍有重要作用，14例IGHV4-34(+)和68例IGHV4-34(-)患者的OS分別為4.7年和27.0年(P<0.000 1)。當(dāng)排除IGHV4-34(+)患者后，HCLc和HCLv患者的OS無明顯差異。多數(shù)患者IGHV基因體細(xì)胞高突變，IGHV4-34(+)患者對嘌呤類似物單藥治療原發(fā)耐藥且疾病進(jìn)展迅速，是HCL的預(yù)后不良的標(biāo)志。

2.5特異的染色體 復(fù)發(fā)性染色體異位在HCL幾乎不存在。有幾項(xiàng)研究利用陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測HCL患者的染色體畸形狀況[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，大約1/3的受試患者存在染色體變異，如5號(hào)染色體三體、7q22-q35缺失、5q13.31重復(fù)等。因此，HCL患者的基因通常是穩(wěn)定的。相反，HCLv患者存在17p缺失[33]。

2.6其他生物學(xué)標(biāo)記 除了Raf-MEK/ERK通路活性，其他信號(hào)途徑如磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(P13K/AKT)途徑的激活可以促進(jìn)HCL細(xì)胞發(fā)育。HCL B淋巴細(xì)胞膜表面過表達(dá)CD123(IL-3Ra)或CD135(FLT3)，這些途徑的激活可以反過來激活P13K/AKT途徑，從而使HCL B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用[34]。LAKIOTAKI等[35]發(fā)現(xiàn)，AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化可促進(jìn)HCL細(xì)胞增殖，BRAF V600E突變體的高表達(dá)可提高磷酸化mTOR(p-mTOR)的表達(dá)水平，并且p-AKT/p-mTOR過表達(dá)是早期復(fù)發(fā)的不利因素，提示AKT的激活可為HCL的治療提供新的依據(jù)。

近期研究發(fā)現(xiàn)，31%的脾邊緣區(qū)淋巴瘤(SMZL)和26%的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)存在KLF2基因突變或缺失，在24例HCL患者中，也有4例患者檢測到KLF2突變，而在其他淋巴樣腫瘤(包括淋巴結(jié)和結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤)中頻率較低。KLF2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控多個(gè)成熟B淋巴細(xì)胞亞群的體內(nèi)分化。HCL中的KLF2突變可導(dǎo)致氨基酸替代，而在其他腫瘤中還可導(dǎo)致明顯的破壞性變異(即無義突變、移碼突變或涉及保守剪接位點(diǎn)的突變)[36]。值得注意的是，CDKN1A/p21(一種促進(jìn)衰老的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑)可以成為KLF2轉(zhuǎn)錄因子的直接靶點(diǎn)[37]。無論是克隆表達(dá)還是在HCL中特異性發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變的體細(xì)胞狀態(tài)尚不清楚，因此需要進(jìn)一步研究以更好地闡明KLF2突變在HCL發(fā)病機(jī)制中的作用。

另外，有報(bào)道稱MAP2K1存在于HCL亞型的患者中。6/15的IGHV4-34(-)HCLv患者、4/9的IGHV4-34(+)HCLv患者和5/7的IGHV4-34(+)HCLc患者均存在MAP2K1突變[38]。MAP2K1編碼絲裂原活化蛋白激酶激酶1，是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成部分。作者在HCLv和IGHV4-34(+)HCL細(xì)胞中編碼N-末端自動(dòng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的第2和第3外顯子均發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變。最近DURHAM等[33]對HCL進(jìn)行了深度靶向突變和拷貝數(shù)分析，研究發(fā)現(xiàn)，除BRAF V600E之外，HCLc中最常見的遺傳改變是染色體7q的雜合缺失，分別在15%和25%的HCLc和HCLv中鑒定出KMT2C(MLL3)突變。此外，在13%的HCLv中鑒定出剪接因子U2AF1的功能性突變。

3 小 結(jié)

HCL是一種較少見的B淋巴細(xì)胞惡性增生性血液系統(tǒng)腫瘤，占白血病的2%～3%。CD38是一種促使B淋巴細(xì)胞活化和增殖的Ⅱ類跨膜糖蛋白，可能是預(yù)防和治療HCL的新靶點(diǎn)。BRAF V600E突變是HCL患者最重要的標(biāo)記，BRAF突變可能引起miRNA表達(dá)的改變，而HCL中miRNA-221/-222過表達(dá)可導(dǎo)致CDKN1B(p27/Kip1)表達(dá)水平降低。BRAF和MEK抑制劑的研究進(jìn)展提供了治療靶標(biāo)，而對其他生物學(xué)標(biāo)記的深入研究也將為HCL患者的診斷和治療帶來巨大變化。