Xpert MTB/RIF在兒童肺結核診斷中的研究進展 *

王 宸，王 曼，杜君華，杜 潔

(1.西安醫(yī)學院，西安 710021；2.陜西省人民醫(yī)院體檢中心，西安 710068)

世界衛(wèi)生組織報告兒童結核病2016年全球約104萬，占結核病總數(shù)的10%，20萬兒童因結核病導致死亡[1]。其中，兒童肺結核病占70%～80%，多發(fā)生在結核病高負擔國家。估計我國兒童結核病20萬例，但年報告登記5 000～8 000例，結核病診斷和報告不足[1]。兒童肺結核以原發(fā)感染為主，肺部以原發(fā)性、浸潤滲出病灶為多，空洞病變少見。結核分枝桿菌載量且痰排菌量低，兒童痰液留取困難，痰涂片鏡檢陽性率極低。因此，早期診治兒童結核相對較困難。2014年世界衛(wèi)生組織推薦利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(XpertMycobacteriumtuberculosisand rifampin-resistant，Xpert MTB/RIF)用于臨床疑診兒童結核病的初診及防治。該技術在2 h左右檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥情況，對兒童肺結核早期診斷有較高臨床價值，具有里程碑意義[2-3]?，F(xiàn)對Xpert MTB/RIF在兒童肺結核的研究及應用進展進行總結分析，以期更好地指導臨床。

1 Xpert MTB/RIF系統(tǒng)的工作原理

Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)以rpoB基因為靶基因，用探針雜交方法檢測合成rpoB基因是否存在突變。結核分枝桿菌rpoB基因為分枝桿菌依賴DNA的RNA聚合酶β亞單位編碼基因，有保守和可變兩種序列，具有顯著種間相似度低和種內(nèi)相似度高的特點，對分枝桿菌可進行有效的菌種鑒定。結核分枝桿菌對利福平耐藥機制是由rpoB基因點突變造成，它可導致利福平無法和β亞基結合而失效。這種突變被分三個區(qū)域，耐利福平結核分枝桿菌菌株突變多集中在Ⅰ區(qū)[4-5]。以上述理論為基礎，Xpert MTB/RIF用分子信標技術，對通過以半巢式實時定量PCR擴增的rpoB基因的192 bp片段進行檢測，同一個反復多重反應體系中，使用互不重疊5個不同核酸分子雜交探針，分別標記不同熒光團，并以探針A～E命名選擇性覆蓋rpoB基因81bp核心區(qū)，該區(qū)域涵蓋99.5%利福平耐藥菌株突變部位。如果待檢測樣本rpoB基因存在突變，探針不能與PCR擴增產(chǎn)物很好雜交，則產(chǎn)生熒光部分或完全被抑制。結核菌耐藥表型及耐藥基因型關系確立，為基于利福平耐藥基因rpoB突變?yōu)榘悬c診斷奠定基礎[4-5]。Xpert MTB/RIF結核試劑盒用5條分子信標探針對結核分枝桿菌特有序列基因上81bp利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determining region，RRDR)進行檢測，第6條探針是用來做內(nèi)部質(zhì)控。當5條分子信標探針與目標靶序列特異性地配對結合，且5條探針均有熒光釋放，結果判為結核分枝桿菌檢測陽性。提示樣品中存在對利福平敏感結核分枝桿菌，且無利福平耐藥性；反之，結果判為結核分枝桿菌檢測陰性。當5條分子信標探針中的一條或者幾條不能很好地與之結合，檢測出少于5條探針結果，提示樣品中存在對利福平耐藥的結核分枝桿菌，故靶序列上某個位點產(chǎn)生了突變，結果判為結核分枝桿菌檢測陽性且對利福平耐藥[6-7]。

2 Xpert MTB/RIF對兒童肺結核的診斷價值

Xpert MTB/RIF可對兒童肺結核做出早期診斷及治療。魯潔等[8]評估Xpert MTB/RIF在兒童結核病的診斷價值，用Revman5.3和Meta-Disc1.4統(tǒng)計軟件進行文獻質(zhì)量評價和meta分析，共納入7個國家13篇文獻和4 661例標本。Xpert MTB/RIF用于診斷兒童結核病匯總靈敏度0.75(95%CI：0.72～0.79)，匯總特異度0.97(95%CI：0.96～0.97)，SROC曲線面積為0.88。對痰、胃液和鼻咽提取物三種樣本meta分析，Xpert MTB/RIF檢測痰靈敏度最優(yōu)76%，痰和鼻咽提取物99%，優(yōu)于胃液。對采用二次取樣方法三項研究進行meta分析，二次取樣可顯著提高靈敏度，由54%提高至71%，且對試驗特異度影響不明顯(均為99%)。Xpert MTB/RIF對兒童結核病具有較高診斷應用價值。

2.1 Xpert MTB/RIF在支氣管肺泡灌洗液中的應用研究 支氣管肺泡灌洗是用支氣管鏡嵌入到肺段或亞段支氣管水平，收集灌洗液。灌洗液涂片查找結核分枝桿菌等，可提高檢出率，尤其適合無痰或排痰困難者。牛波等[9]收集確診肺結核126份灌洗液標本，行羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、藥物敏感性試驗和Xpert MTB/RIF檢測。灌洗液中Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌的檢出率為59.52%，28份培養(yǎng)陽性標本檢測結核分枝桿菌靈敏度為96.43%，98份培養(yǎng)陰性標本中，檢測結核分枝桿菌靈敏度為48.98%。YIN等[10]對255例灌洗液用涂片、培養(yǎng)、藥敏和Xpert MTB/RIF檢測評估Xpert MTB/RIF檢測價值。痰涂片、培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測支氣管肺泡灌洗液靈敏度分別為8.4%，28.9%和53%，三種方法特異度均為100%。Xpert MTB/RIF檢測1例多耐藥結核，與藥敏結果一致。Xpert MTB/RIF 是一種快速、簡便、陽性率高的檢測方法，可在2 h內(nèi)提供利福平耐藥結核結果，為臨床更快更早地提供診斷依據(jù)。

2.2 Xpert MTB/RIF在糞便標本中的應用研究 Xpert MTB/RIF檢測糞便結核分枝桿菌有十分重要的意義。兒童生理特點決定頻繁吞咽動作，其糞便中可檢測到結核分枝桿菌，糞便更易收集。NICOL等[11]收集115例兒童肺結核糞便和痰標本行Xpert MTB/RIF檢測。17例經(jīng)培養(yǎng)確診糞便中，Xpert MTB/RIF檢測8例糞便結核分枝桿菌陽性，5例并發(fā)HIV感染糞便樣本中檢出4例樣本結核分枝桿菌陽性，12例未被HIV感染的樣本中檢測出4例結核分枝桿菌陽性。Xpert MTB/RIF檢測糞便結核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為47%和99%。以糞便為樣本行Xpert MTB/RIF試驗，需合理控制樣本量大小及糞便菌種群量，以免其限制或殺死結核分枝桿菌影響靈敏度和特異度，而導致試驗偏倚。WALTERS等[12]研究顯示糞便中其他細菌生長速度過快致結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率低，以往以糞便為樣本的Xpert MTB/RIF研究，結核分枝桿菌檢出的靈敏度和特異度分別為25%～69%，91.7%～100%。靈敏度低除因糞便樣本堵塞卡槽、PCR抑制之外，還可與糞便樣本含量不足有關。WALTERS等[12]以Xpert MTB/RIF檢測胃液/誘導痰液為金標準，Xpert MTB/RIF檢測0.6 g和1.2 g糞便樣本，采取一種創(chuàng)新處理糞便標本方法，用20例肺結核者和20例非肺結核對照研究。Xpert MTB/RIF檢測0.6 g和1.2 g糞便靈敏度、特異度分別85%，84%和100%，94%。KOKUTO等[13]糞便XpertMTB/RIF檢測診斷肺結核報告，痰涂片陽性中，糞便Xpert MTB/ RIF靈敏度100%，痰涂片弱陽性，靈敏度81.0%，痰涂片陰性靈敏度是50%；非肺結核組糞便Xpert MTB/ RIF檢測均陰性，特異度100%。用這種創(chuàng)新糞便處理技術，糞便代替痰液，接近痰液樣本Xpert MTB/RIF檢測靈敏度和特異度，在診斷兒童肺結核方面是一種技術創(chuàng)新革命[14]。

2.3 Xpert MTB/RIF在胃液標本中的應用研究 兒童睡眠時會吞咽下部分痰液，清晨空腹留取胃液也可作為樣本，進行Xpert MTB/RIF檢測[15]。錢雪琴等[16]2014年研究胃液檢測對兒童肺結核的診斷價值。84例患兒25例結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，陽性率29.8%，其中BACTEC MGIT 960系統(tǒng)與羅氏培養(yǎng)法的陽性率分別為26.2%及19%。痰涂片陽性者30例，陽性率35.7%，其中涂片陽性以下者占陽性病例的93.3%。胃液中分枝桿菌載量低，離心濃縮集菌、鏡檢仔細和多次送檢標本或增加標本采集量是關鍵。SINGH等[15]收集130例可疑胸內(nèi)結核病患兒的胃液和誘導痰液，樣本被用于涂片、BACTEC-MGIT培養(yǎng)、多重PCR檢查及Xpert MTB/RIF檢測。對痰涂片和痰培養(yǎng)結果均為陽性的樣本進行Xpert MTB/RIF檢測，總靈敏度95.6%，對痰涂片陰性但培養(yǎng)陽性樣本，靈敏度62.5%。胃液與誘導痰液合并為樣本可提高Xpert MTB/RIF檢測檢出率。較長階段儲存后仍能保持較高的靈敏度和特異度，為兒童肺結核確診提供相對長時間、能保留樣本以便反復檢測。

3 Xpert MTB/RIF在檢測抗結核藥耐藥方面的價值

利福平是一線抗結核藥物，可殺死生長分裂旺盛的結核分枝桿菌和慢生長或休眠期的病原菌，研究顯示細菌對利福平的自發(fā)耐藥率10-10～10-7。多項針對臨床分離菌株的研究顯示90%以上無流行病學關聯(lián)的利福平耐藥的結核分枝桿菌株在rpoB基因上81bp的核心區(qū)域，即利福平耐藥決定區(qū)存在突變，包括點突變或短的插入、缺失突變，點突變是最常見的類型[17]。Xpert MTB/RIF檢測技術對耐多藥結核病的早期診斷和治療有十分重要的意義。Xpert MTB/RIF試驗以利福平耐藥相關rpoB基因為靶基因檢測結核分枝桿菌，所以是檢測利福平耐藥的直接手段，臨床實踐中可以指導用藥。但其不能檢測出其他一線和二線抗結核藥物的耐藥情況，獨立的耐藥相關基因突變可以相互作用影響耐藥菌株適應性，稱為“異位顯性”作用，協(xié)同作用稱為“正向顯性”，拮抗作用稱為“負向顯性”。目前認為正向異位現(xiàn)象可能是促進耐多藥和廣泛耐藥菌株廣泛傳播的主要原因，但臨床實踐中還需依靠藥敏試驗來判斷耐藥情況。

4 Xpert MTB/RIF與其他方法診斷價值的比較

Xpert MTB/RIF成人應用價值得到較多肯定，兒童肺結核方面文獻相對較少。張愛梅等[18]評價Xpert MTB/RIF兒童結核病中應用價值，收集109例臨床疑似結核病患者標本，分別進行熒光痰涂片鏡檢、液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF檢測及血結核T細胞斑點試驗檢測，Xpert MTB/RIF對疑似兒童結核病靈敏度28.6%，特異度87.5%。涂陽培陽標本中靈敏度均100%，涂陰培陽為50.0%；利福平耐藥檢測靈敏度及特異度均100.0%。Xpert MTB/RIF靈敏度(28.6%)優(yōu)于熒光涂片(20.8%)，差異無統(tǒng)計學意義；與BACTEC MGIT 960的液體靈敏度27.3%相比，無統(tǒng)計學差異性；低于T細胞斑點試驗(59.7%)，差異有統(tǒng)計學顯著性意義。Xpert MTB/RIF檢測在兒童結核病并不具有明顯優(yōu)勢，但其迅速檢測利福平耐藥可為結核病診療提供幫助。Xpert MTB/RIF檢測痰或胃液標本，對于痰培養(yǎng)陽性兒童肺結核靈敏度和特異度分別為62%～68%和98%～100%，陽性率是涂片鏡檢的1.7倍[19-20]。Xpert MTB/RIF除了用于檢測呼吸道標本(如痰、胃液、鼻咽吸取物或支氣管肺泡灌洗液)外，也可以用于檢測糞便標本。培養(yǎng)陽性兒童肺結核糞便Xpert MTB/RIF檢測的靈敏度為47%[21]。Xpert MTB/ RIF通過檢測痰液診斷兒童肺結核的匯總靈敏度為62%，匯總特異度為98%。通過對支氣管肺泡灌洗液和胃抽吸物這兩種標本分別進行涂片、培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF檢測，均顯示Xpert MTB/RIF的檢測靈敏度顯著高于另外兩種方法[20]。LU等[22]分別對確診結核兒童痰液、胃抽吸液、肺泡灌洗液和腦脊液等樣本進行Xpert MTB/RIF檢測，顯示不同樣本類型的陽性率顯著不同，且胃抽吸液的檢出陽性率最高[23]。HIV感染兒童結核中痰/胃抽吸物Xpert MTB/RIF靈敏度為60%，特異度為98%，糞便Xpert MTB/ RIF靈敏度63%和特異度99%[24]。田斌等[25]系統(tǒng)評價QFT-GIT對兒童肺結核臨床診斷價值，用Stata軟件進行meta分析，QFT-GIT對兒童肺結核診斷試驗靈敏度點估計值為0.76，95% CI=0.65～0.84，特異度點估計值為0.98，95%CI=0.91～1.00。認為QFT-GIT具有排除肺結核診斷能力。紀麗微等[26]對2 284例評價Xpert MTB/RIF用于結核分枝桿菌聯(lián)合檢測價值，1 097例活動結核者、1 187例非結核者，Xpert MTB/RIF陽性檢出率最高，靈敏度和特異度高，可取代結核分枝桿菌DNA熒光定量法加結核桿菌RNA恒溫擴增加線性探針結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)與離心濃縮涂片法、BACTECMGIT960液體培養(yǎng)及一二線藥敏試驗組成結核分枝桿菌聯(lián)合檢測，對結核病和耐多藥結核病的快速診斷具有極高的應用價值。從目前研究無論痰還是非痰液標本的Xpert MTB/RIF檢測陽性率相對較高，提高兒童肺結核的檢出率。

5 Xpert MTB/RIF應用優(yōu)點及局限性

Xpert MTB/RIF檢測準確快速、安全性高、有較高靈敏度和良好特異度等特點，適合各級醫(yī)院；Xpert MTB/RIF檢測可對多樣本檢測，適用范圍廣，可以對兒童肺結核做早期診斷及耐藥判斷。但Xpert MTB/RIF系統(tǒng)對利福平耐藥有假陽性，樣本中存在異質(zhì)性利福平耐藥時結果難以判斷，不能檢測除利福平之外抗結核藥物耐藥。另外，對抗結核治療者，Xpert MTB/RIF檢測結果陽性不表示活動結核，不能以此判斷療效和結核預后。有學者對Xpert MTB/RIF 檢測1 486例結果中常見異常原因行回顧分析。異常結果類型57份，占3.8%，出現(xiàn)“錯誤”、“無效”及“無結果”。其中，“錯誤”46份，占80.7%，“無效”6份，占10.5%，“無結果”5份，占8.8%。57例異常結果中，發(fā)生率較高的標本為胸腔積液、痰液和腹腔積液，而肺泡灌洗液和腦脊液等標本異常結果發(fā)生率較低[27]。但在Xpert MTB/RIF檢測實際操作時多種原因可導致出現(xiàn)異常結果，其原因主要有人為因素、標本因素及實驗室環(huán)境與儀器因素，個別試劑盒質(zhì)量問題也可出現(xiàn)異常結果。樣本體積過少或過多、對黏稠樣本消化或樣本孵育時間不充分、各種因素導致PCR反應抑制。標本黏稠、含有食物殘渣或血液痰液標本、樣本中含有色素顆粒如腹胸水標本中的色素顆粒容易堵塞PCR反應管尖端，出現(xiàn)異常結果。Xpert MTB/RIF檢測技術質(zhì)量控制體系缺陷、實驗室環(huán)境及儀器因素等也可出現(xiàn)異常結果。