miRNAs與血管損傷及血管重塑

陸洲成 桂培根

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽421001）

人體內(nèi)血液的流動需要血管。而血管在很多心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等中也扮演著重要角色。關(guān)于血管損傷和重塑的分子機制已經(jīng)研究了近10年，并且取得了重大進(jìn)展。據(jù)報道，許多基因參與調(diào)節(jié)血管重塑和血管生成，其中miRNA在血管損傷以及重塑中也起到重要作用，并且成為科學(xué)研究的新焦點[1]。

根據(jù)最近在人類基因組領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)，人類基因組近60%的轉(zhuǎn)錄本并不編碼蛋白質(zhì)，這部分不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本被稱為非編碼RNA。生物信息學(xué)研究表明，非編碼RNA在復(fù)雜的生物體內(nèi)存在的數(shù)量更多。功能研究表明，非編碼RNA在調(diào)控表觀遺傳過程中具有重要作用，是生命活動的重要調(diào)控因子。在非編碼RNA中，miRNAs的功能最為突出，因此受到了廣泛的研究。在本綜述當(dāng)中，對miRNAs在血管功能維護(hù)、損傷、重塑和血管生成中的功能做一總結(jié)。此外，本綜述還對miRNAs在治療動脈粥樣硬化、高血壓和其他血管相關(guān)疾病中的作用做一總結(jié)。

1miRNAs

miRNAs的核苷酸組成在20-25bp之間，幾乎存在于所有生物體中，廣泛參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在動物細(xì)胞中，miRNAs從基因組轉(zhuǎn)錄為primiRNA，并在細(xì)胞核內(nèi)由Drosha-DGCR8復(fù)合物加工成60-70bp具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。進(jìn)而通過Exportin-5核轉(zhuǎn)運蛋白將pre-miRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，胞漿當(dāng)中的Dicer蛋白能夠?qū)⑶绑wpre-miRNA切割成雙鏈分子。雙鏈RNA的兩條單鏈分離，其中一條單鏈會被降解，另一條鏈則被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)當(dāng)中，RISC通過堿基配對原理與mRNA的3'UTR相互作用，誘導(dǎo)mRNA的降解或翻譯抑制。自1993年在秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditiselegans)中發(fā)現(xiàn)第一個miRNA以來，轉(zhuǎn)錄組高通量分析被廣泛應(yīng)用于miRNA的研究當(dāng)中，使得新發(fā)現(xiàn)的miRNAs的出現(xiàn)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長[2]。到目前為止，在miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)注冊了超過1800個人類物種的miRNAs。生物信息學(xué)分析表明，一個miRNA可能直接抑制數(shù)百個目標(biāo)基因的表達(dá)。此外，至少有三分之一的mRNA可以被miRNAs調(diào)控，提示miRNAs可以調(diào)控許多重要的細(xì)胞活動和基本病理生理過程。

2 miRNAs對血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管表面的一層上皮細(xì)胞。因此，了解內(nèi)皮細(xì)胞在血管疾病中的作用機制對于制定治療心血管疾病的策略至關(guān)重要[3]。Dicer蛋白是miRNAs成熟的關(guān)鍵酶，對Dicer進(jìn)行敲除會引起內(nèi)皮細(xì)胞中miRNAs的缺失，進(jìn)而影響胚胎內(nèi)的新生血管生成，導(dǎo)致胚胎死亡，這意味著miRNAs對于維持內(nèi)皮細(xì)胞的功能至關(guān)重要。部分miRNAs能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的一些表型，如增殖、遷移和細(xì)胞間黏附等細(xì)胞相互作用，進(jìn)而影響初始的血管網(wǎng)絡(luò)形成。這些miRNAs主要包括miR-21，miR-24，miR-34a，miR-92a，miR-126，miR-200b 以及 miR-210[4]。這部分miRNA通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移來抑制血管生成，例如miR-21通過靶向PPAR-α和RhoB來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]。miR-200b通過下調(diào) Ets-1、VEGF、VEGFR-2 和 GATA2 基因的表達(dá)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。miR-92a通過抑制整合素α5亞基的基因表達(dá)抑制細(xì)胞生長[6]。而miR-221/222通過負(fù)調(diào)控c-kit的表達(dá)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[7，8]。此外，除了通過調(diào)控GATA2抑制血管生成之外，miR-24還通過靶向PAK4誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。而miR-34a通過抑制SIRT1基因表達(dá)來組織血管生成，對于內(nèi)皮細(xì)胞的衰老過程具有重要意義。

而另外的一些miRNA則被證明可以促進(jìn)血管生成。例如，miR-126通過直接調(diào)控靶基因p21激活激酶(PAK1)的表達(dá)來調(diào)控血管的完整性以及血管生成的過程。根據(jù)另一項研究的結(jié)果，miR-126敲除小鼠心肌缺血后出現(xiàn)血管生成和增殖缺陷。因此，miR-126敲除小鼠不能向缺血心肌提供足夠的營養(yǎng)和氧氣，導(dǎo)致miR-126敲除小鼠死亡率顯著增加。同樣，在低氧條件下，miR-210在內(nèi)皮細(xì)胞存活、遷移和分化以及管腔形成過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。除了上述的miRNAs外，其他miRNAs也參與內(nèi)皮細(xì)胞表型的調(diào)控。例如miR-16，miR-424。miR-130 a以及Let-7等。

3miRNAs調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖、遷移以及表型轉(zhuǎn)化

除了直接調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)之外。眾多研究表明，多種miRNAs能夠調(diào)節(jié)血管活性分子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和生長因子的表達(dá)，進(jìn)而對血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如在血管平滑肌細(xì)胞中敲除Dicer會導(dǎo)致胚胎死亡，并且胚胎的組織學(xué)檢測結(jié)果顯示有明顯的血管發(fā)育異常。這些研究結(jié)果提示miRNAs在血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。而也有很多研究結(jié)果表明如 miR-21、miR-133、miR-143/145、miR-221/222和miR-663等都在VSMC的功能中起到了至關(guān)重要的作用[4，9]。在PDGF處理下，miR-221/222表達(dá)顯著上調(diào)，而miR-133、miR-143/145和miR-663表達(dá)顯著下調(diào)。miR-221/222表達(dá)上調(diào)能夠直接抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p27Kipl和p57Kip2的表達(dá)，進(jìn)一步造成了VSMC增殖及遷移的增加，同時抑制血管平滑肌細(xì)胞生物標(biāo)志物的表達(dá)[10]。同樣，miR-21的過表達(dá)也促進(jìn)了VSMC的增殖，進(jìn)而減少了細(xì)胞的凋亡。另一方面，miR-133通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp-1的表達(dá)來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[11]，而miR-143/145通過直接抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF4/5表達(dá)來抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的分化，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致頸動脈球囊損傷[12]。進(jìn)一步通過敲除實驗進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)miR-143/145在敲除之后血管平滑肌細(xì)胞的收縮功能能夠被回復(fù)[13]。而miR-663能夠通過抑制轉(zhuǎn)錄因子JunB和肌球蛋白輕鏈9的表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的分化，抑制PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。這些研究表明，miRNAs在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞這兩種主要的血管類型細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，提示miRNAs可能參與病變血管損傷、重塑和血管生成等過程，并且可能參與動脈粥樣硬化、高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等病理過程。

4miRNAs與血管相關(guān)性疾病

內(nèi)皮損傷和血管管腔狹窄是引起動脈粥樣硬化、高血壓、肺動脈高壓（PAH）等心血管疾病的主要原因。迄今為止，許多miRNAs已被證明參與了這些病理過程。動脈粥樣硬化是血管內(nèi)皮損傷引起的最常見的動脈綜合征之一，它涉及炎癥、脂質(zhì)沉積、纖維化和斑塊形成等多種復(fù)雜的病理過程，一些miRNAs已經(jīng)被證明與這些過程相關(guān)。例如國外研究報道了在急性冠脈炎形成的早期，YY1/HDACs/miR-155/HBP1信號通路參與了泡沫細(xì)胞的形成過程[14]。研究中發(fā)現(xiàn)miR-155在動脈粥樣硬化(ApoE-/-)小鼠的巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且miR-155介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞中oxLDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)攝取以及ROS的產(chǎn)生。更重要的是，通過miR-155拮抗劑對巨噬細(xì)胞中的miR-155表達(dá)進(jìn)行沉默可以明顯降低巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)水平，進(jìn)而減少小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生。研究結(jié)果提示miR-155可能是動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。與此同時，有研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化(ApoE-/-)小鼠中特異性敲除白細(xì)胞中的miR-155能夠顯著減少血小板細(xì)胞的大小和病變巨噬細(xì)胞的數(shù)量。其分子機制主要是通過減少趨化因子CCL2的表達(dá)實現(xiàn)的。與之相反，在高脂喂養(yǎng)的動脈粥樣硬化(ApoE-/-)小鼠中，miR-181b在主動脈內(nèi)膜的表達(dá)顯著減少。miR-181b通過直接抑制importin-a3（NF-κB核轉(zhuǎn)位所需蛋白）的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞中NF-KB應(yīng)答基因的表達(dá)，如VCAM-1和E-selectin。研究結(jié)果表明，在機體內(nèi)轉(zhuǎn)入miR-181b可以有效抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。這些研究表明，調(diào)控miRNAs可能為動脈粥樣硬化提供一種新的治療方法。高血壓和肺動脈高壓是由血管重塑造成的，并且血管重塑往往還會繼續(xù)發(fā)展使得高血壓和肺動脈高壓進(jìn)一步惡化。最近的研究表明多種miRNAs參與高血壓和肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程，例如 miR-130a、miR-145、miR-155、miR-20、miR-424和miR-503。在自發(fā)性高血壓小鼠以及血管緊張素II誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中，miR-130a的表達(dá)顯著上調(diào)。抑制miR-130a的表達(dá)能夠顯著抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及血管重塑[15]。而在自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)miR-155表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)miR-155能夠抑制血管緊張素II1型受體表達(dá)，進(jìn)而抑制高血壓的形成[16]。多種miRNAs參與PAH的發(fā)生發(fā)展，其主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子來實現(xiàn)的，是因為它們可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞[17]。在患有PAH的人或嚙齒類動物的肺血管平滑肌細(xì)胞中，miR-204的表達(dá)顯著下調(diào)。miR-204表達(dá)的下調(diào)與PAH的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在髓內(nèi)動脈內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)miR-424或miR-503可使內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入靜息狀態(tài)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞招募血管平滑肌細(xì)胞的能力，并且通過直接抑制FGF2和FGER1表達(dá)減少PAH的發(fā)展。與之相反，miR-145在PAH患者以及PAH小鼠的肺組織中表達(dá)顯著上調(diào)。miR-145的沉默會導(dǎo)致右心室收縮壓降低以及右心室肥大，并且對肺血管重塑也有一定作用。這些研究表明對miRNAs表達(dá)進(jìn)行調(diào)控可能是治療高血壓以及PAH的新型策略。

今年的一些研究表明miRNAs在一些疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的協(xié)同作用。例如，CD44的3’UTR 可以結(jié)合 miR-216a、miR-330 和 miR-608，進(jìn)而影響CDC42的表達(dá)，從而調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞系MT-1的增殖、凋亡及血管生成的表型[18]。這些研究結(jié)果顯示miRNAs可能在血管重塑的過程中存在相互聯(lián)系。然而目前還沒有直接的實驗證明miRNAs在血管重塑中具有協(xié)同作用。但是有報道稱有幾種miRNAs能夠靶向參與血管損傷及相關(guān)疾病的同一基因，如miR-217和miR-34a[19]均能靶向Sirt1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老[20]。因此，研究miRNAs在血管重塑過程中的協(xié)同效應(yīng)是今后一個非常有價值的方向。

5 血清中的miRNAs可以作為血管疾病的生物標(biāo)志物

由于miRNA在血漿中表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，有可能利用這一特性開發(fā)血管疾病的分子標(biāo)記物。根據(jù)文獻(xiàn)報道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-208a可以作為心肌缺血的血清標(biāo)志物，且靈敏度高和特異性也較好[5，6]。同樣，在PAH患者的血漿中多種miRNAs含量也發(fā)生顯著變化[21]。已經(jīng)有各項研究證明，在PAH患者血清當(dāng)中，多種miRNAs含量是下調(diào)的，例如miR-451和miR-1246，而另外一些miRNAs含量則是上調(diào)的，例如miR-23b、miR-130a和miR-191。這些研究對于miRNAs在臨床上作為PAH的生物標(biāo)志物具有重要意義。目前對于PAH的診斷方法仍然采用的是在X射線透視下進(jìn)行右心導(dǎo)管插管檢查，操作上極為繁瑣且對主治醫(yī)師的手術(shù)技術(shù)要求較高。因此開發(fā)出更加簡單且高效的PAH診斷方法就顯得尤為迫切，尋找特異性高以及敏感度好的血漿標(biāo)志物可能是很好的一個方向。雖然有研究報道PAH患者血漿中的miRNAs可以作為生物標(biāo)志物，但是對于miRNAs作為PAH標(biāo)志物其靈敏度以及特異性等特性都需要臨床研究進(jìn)行檢驗，目前在這一方面仍然缺乏足夠的臨床研究。

6 問題與展望

目前對于miRNAs在心血管疾病當(dāng)中的研究已經(jīng)非常深入及廣泛，但仍存在許多限制其大規(guī)模臨床應(yīng)用的問題。首先是因為一個miRNA可能針對數(shù)十個甚至數(shù)百個基因，因此人為干預(yù)miRNA的表達(dá)可能會導(dǎo)致一系列下游基因的變化，從而對人體造成不可預(yù)知的傷害。此外，人工修飾的miRNAs對人體是否會造成毒副作用也尚未確定。miRNA的脫靶效應(yīng)會對人體造成何種影響目前也不是特別清楚。其次目前關(guān)于miRNA在體內(nèi)代謝上的藥代動力學(xué)了解得還不夠。因此，進(jìn)一步的研究需要對miRNA的功能和機制做進(jìn)一步更深入的研究，以便為miRNAs在血管重塑和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)上的臨床應(yīng)用鋪平道路。最近RNA領(lǐng)域的研究也主要集中在miRNAs對內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC的影響上。對miRNAs的研究范圍應(yīng)該進(jìn)一步擴大到血管中的其他細(xì)胞成分當(dāng)中，如成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。