微生物生產(chǎn)威蘭膠的研究進(jìn)展

,2,2,2,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004; 2.廣西水牛奶工程技術(shù)研究中心,廣西南寧 530004)

多糖(polysaccharide)是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物[1]。其來源廣泛,其中由部分微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的水溶性多糖被稱為胞外多糖(exopolysaccharides)。若聚合物與細(xì)胞膜以及培養(yǎng)基中釋放的胞外多糖結(jié)合緊密,則胞外多糖中還含有莢膜多糖(圖1),這些多糖最后可以分泌到周圍的液體介質(zhì)中或嵌入到生物膜中[2]。微生物胞外多糖的聚合通常發(fā)生在內(nèi)膜的細(xì)胞質(zhì)表面或周質(zhì),之后被輸出到細(xì)胞外。除了為微生物提供物理屏障外,它們還可以為細(xì)胞提供額外的生物保護(hù)[3]。這些微生物具有生產(chǎn)周期短,生產(chǎn)條件不受限制,生產(chǎn)原料廣泛(含碳氮源的廢渣和廢液)的特點(diǎn),因此利用微生物生產(chǎn)胞外多糖比化學(xué)合成法更具經(jīng)濟(jì)效益。

圖1 胞外多糖的組成:釋放于介質(zhì)的胞外多糖(MRP)與莢膜多糖(CPS)Fig.1 Composition of extracellular polysaccharides:exopolysaccharide(MRP)and capsular polysaccharide(CPS)released from the medium

目前廣泛使用的胞外多糖有鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)生產(chǎn)的鞘氨醇(sphingans)[4],黃單胞菌生產(chǎn)的黃原膠(xanthan)[5],小核菌生產(chǎn)的小核菌葡聚糖(Scleroglucan)[6],芽短梗霉菌生產(chǎn)的普魯蘭多糖(pullulan)[7],裂褶菌生產(chǎn)的裂裥多糖(Schizophyllan)[8],鏈球菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)[9],根瘤菌生產(chǎn)的琥珀聚糖(succinoglycan)[10]等。其中,由鞘氨醇科菌株合成的生物聚合物具有相似但不相同的結(jié)構(gòu),被統(tǒng)稱為鞘氨醇[11]?，F(xiàn)階段,鞘氨醇有結(jié)冷膠(S-60)、威蘭膠、Rhamsan(S-194)、Sanxan、S-88、Diutan(S-657)、S-198等。其中,威蘭膠因其獨(dú)特的性質(zhì)成為研究熱點(diǎn)。

威蘭膠(S-130)是由摩爾比為3.1∶2.3∶4.5∶1.0的D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、L-鼠李糖和L-甘露糖以糖苷鍵連接而成,四糖骨架結(jié)構(gòu)為[→3)-β-D-Glc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glc-(1→4)-α-L-Rha(或者M(jìn)an)-(1→],并且擁有一個連接在葡萄糖單元上的鼠李糖或甘露糖側(cè)鏈,其側(cè)鏈的鼠李糖與甘露糖單元比例為3∶1[12]。威蘭膠溶液具有在高溫(高達(dá)150 ℃)與廣泛酸堿度(pH2～12)中黏性穩(wěn)定的獨(dú)特性質(zhì)[13];與已廣泛使用的黃原膠相比,威蘭膠的分子量較低[14],但在相同濃度下,威蘭膠溶液呈現(xiàn)出更高的表觀粘度和更高的粘彈性模量(損耗和儲存模量)。因此其在混凝土、石油、生物醫(yī)學(xué)、藥物、化妝品與食品領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值與良好的發(fā)展前景,例如日本已將威蘭膠列入合法的食品添加劑[15],其中建筑、石油與廢水處理方面的應(yīng)用被廣泛研究報道(表1)。然而,目前鞘氨醇單胞菌發(fā)酵威蘭膠的糖轉(zhuǎn)化率較低,一般在30%～40%,而黃原膠在70%～90%[16],這使得威蘭膠成為最昂貴的生物膠之一。因此,提高糖轉(zhuǎn)化率,降低成本成為了威蘭膠生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵所在。近期研究人員開始探究各種育種方式和優(yōu)化培養(yǎng)基的方法,以提高生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化率,降低生產(chǎn)成本。

表1 威蘭膠的應(yīng)用研究Table 1 The application researches of Welan gum

1 鞘氨醇單胞菌中威蘭膠的代謝途徑解析

微生物胞外多糖生產(chǎn)具有簡單、穩(wěn)健、可重復(fù)的性質(zhì),且易于通過生長條件控制(例如碳源的類型和濃度,pH或溫度)。然而,盡管可以生產(chǎn)具有恒定特性(例如組成、純度和均勻性)的胞外多糖,但仍需要更好地理解其合成途徑,以達(dá)到最大化生產(chǎn)并獲得經(jīng)濟(jì)可行的過程。目前,在鞘氨醇單胞菌中,其合成威蘭膠的代謝途徑已經(jīng)闡明,即包括細(xì)胞代謝途徑(碳源攝取途徑與中心代謝途徑)和威蘭膠合成途徑(五糖單元的組裝、聚合與分泌)。

1.1 鞘氨醇單胞菌細(xì)胞代謝途徑

細(xì)菌的碳源攝取包括周質(zhì)直接氧化途徑和細(xì)胞內(nèi)磷酸化途徑,前者僅存在于某些細(xì)菌中,后者在細(xì)菌中無處不在。中心代謝途徑包括糖酵解途徑(EMP)、磷酸戊糖途徑(PPP)、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸途徑(ED)和三羧酸循環(huán)(TCA)為細(xì)胞的生理活動和產(chǎn)物合成提供能量和還原能力[26]。研究表明Alcaligenessp. CGMCC2428中的中心代謝酶如KDPG醛縮酶和PGD酶的活性均存在,因此,ED和PPP途徑都存在于該生物體中。且鞘氨醇單胞菌為好氧微生物,則一定發(fā)生TCA。同時,研究人員測出PFK酶的比活性為零,因此認(rèn)為在Alcaligenessp. CGMCC2428中沒有EMP途徑。生產(chǎn)胞外多糖的機(jī)制包括以下步驟:糖核苷酸前體的合成;重復(fù)單元的聚合;聚合重復(fù)單元的輸出[27]。

1.2 威蘭膠合成途徑解析

在鞘氨醇單胞菌合成威蘭膠的步驟包括:a. 葡萄糖由葡萄糖激酶磷酸化為葡萄糖-6磷酸或者通過細(xì)胞周質(zhì),在葡萄糖脫氫酶(GDH)的作用下聯(lián)合吡咯喹啉醌作為輔助因子產(chǎn)生葡萄糖酸鹽葡糖酸鹽通透酶的主動轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中,然后通過ATP依賴性葡糖酸激酶反應(yīng)將葡萄糖酸鹽磷酸化,并產(chǎn)生6-磷酸葡糖酸鹽;b. 形成的葡萄糖-6-磷酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸(Fru-6-Ph)和葡萄糖-1-磷酸(Glu-1-Ph),共同參與核苷酸前體的形成和威蘭膠的產(chǎn)生;c. 果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為甘露糖-6-磷酸,隨后轉(zhuǎn)變?yōu)楦事短?1-磷酸,最終成為二磷酸鳥苷-甘露糖(GDP-Man);葡萄糖-1-磷酸則分別轉(zhuǎn)化為二磷酸尿苷-葡萄糖(UDP-Glc)和鄰苯二甲酸二異十三酯-葡萄糖(dTDP-Glc),二磷酸尿苷葡萄糖最終轉(zhuǎn)化為二磷酸尿苷-葡萄糖醛酸(dTDP-GlcA)和焦磷酸異戊二烯-葡萄糖(IDP-Glc),鄰苯二甲酸二異十三酯-葡萄糖最終轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸二異十三酯-鼠李糖(dTDP-Rha);d. 四種終產(chǎn)物縮合形成威蘭膠[28](圖2)。

圖2 鞘氨醇單胞菌中威蘭膠合成途徑Fig.2 Metabolic pathways for the production of synthetic Welan gum in Sphingomonas sp.注:F-6-P:果糖-6-磷酸,R-5-P:丙炔酸-5-磷酸,GAP:甘油醛-3-磷酸,6-PG:6-磷酸葡萄糖酸鹽,KDPG:2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸鹽,AcCoA:乙酰輔酶A,E-4-P:赤蘚糖-4-磷酸,G-1-P:葡萄糖-1-磷酸,M-6-P:甘露糖-6-磷酸,M-1-P:吡喃糖-1-磷酸,UDP-Glc:UDP-葡萄糖,UDP-GlcA:UDP-葡萄糖醛酸,dTDP-Glc:dTDP-葡萄糖,dTDP-Rha:dTDP-鼠李糖,GDP-man:GDP-甘露糖,IP:類異戊二烯磷酸鹽,IDP:類異戊二烯焦磷酸鹽。

1.3 提高微生物合成威蘭膠的育種策略

1.3.1 威蘭膠合成途徑關(guān)鍵酶 核苷酸糖前體的生物合成,是威蘭膠合成的基礎(chǔ)。許多研究已經(jīng)表明,核苷酸糖前體生物合成途徑中,磷酸葡萄糖苷酶(PGMG)、尿嘧啶二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPG)、UDP-葡萄糖脫氫酶(UGDG)、磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶(TGP)是關(guān)鍵酶[29]。其中TGP酶是dTDP-1-鼠李糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[30];PMI是GDP-甘露糖生物合成中的關(guān)鍵酶[31]。

1.3.2 誘變育種技術(shù) 誘變育種即通過利用物理、化學(xué)等因素誘導(dǎo)動植物的遺傳特性產(chǎn)生變異,再通過不同的篩選方式從變異群體中選擇符合需求的個體,從而得到新品種的育種方法。誘變育種變異頻率高,可大幅度地獲得新品種。a.利用誘變技術(shù)得到高產(chǎn)菌株。利用低能氮離子束注入技術(shù)對Alcaligenessp.NX-3進(jìn)行誘變,篩選得到突變菌株比野生菌株威蘭膠生產(chǎn)量高34.4%,并且發(fā)現(xiàn)突變菌株中磷酸葡萄糖苷酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脫氫酶和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶的比活性均高于野生型菌株[32];b.獲得耐高溫菌株以減少降溫成本。溫度耐受性可歸因于熱休克蛋白和氧化應(yīng)激蛋白的過度表達(dá)[33],通過等離子體誘變獲得耐高溫菌株Sphingomonassp. HT-1,該菌株在37 ℃生產(chǎn)威蘭膠濃度達(dá)(26.8±0.34) g/L。

1.3.3 代謝工程技術(shù) 代謝工程即利用基因重組技術(shù)改造細(xì)胞的代謝途徑,從而使細(xì)菌生產(chǎn)出特定目的產(chǎn)物的育種方法。2012年鞘氨醇單胞菌ATCC 31555測序工作的完成,為其代謝工程發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。代謝工程優(yōu)化代謝途徑,實(shí)現(xiàn)威蘭膠的高效合成的方法:a. 通過基因工程技術(shù)獲得高產(chǎn)菌株。向Sphingomonassp. HT-1中插入可表達(dá)透明顫菌血紅蛋白VHb基因,從而改善發(fā)酵過程中的溶氧水平,最終威蘭膠的產(chǎn)量從25.3 g/L增加到34.6 g/L,且威蘭膠溶液的流變性基本保持不變[34]。b. 減少色素帶來的純化成本。將透明顫菌血紅蛋白基因與β-半乳糖苷酶(lacZ)啟動子結(jié)合,插入到Alcaligenessp. ATCC31555染色體的八氫番茄紅素合成酶(crtB)基因區(qū)域,從而得到不含胡蘿卜素的威蘭膠以減少后期乙醇的使用量,最終工程菌株的威蘭膠產(chǎn)量高于野生菌株為(24±0.4) g/L,且流變性更好[35]。

2 發(fā)酵法生產(chǎn)威蘭膠菌株的菌種選育

為實(shí)現(xiàn)威蘭膠的工業(yè)化應(yīng)用,作為威蘭膠的生產(chǎn)菌株則應(yīng)具備能在胞內(nèi)高效合成并快速轉(zhuǎn)運(yùn)威蘭膠至胞外,碳源轉(zhuǎn)化率高,生長迅速、發(fā)酵周期短,產(chǎn)物雜質(zhì)少、易純化分離等特點(diǎn)。近年來,科研工作者通過自然選育、誘變育種及代謝工程等育種策略實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)威蘭膠菌株的選育,為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)(表2)。

表2 產(chǎn)威蘭膠的不同菌株的培養(yǎng)基及威蘭膠產(chǎn)量Table 2 Culture medium of different strains producing Welan gum and yield of Welan gum

3 提高威蘭膠生產(chǎn)效率的策略

3.1 使用廉價碳源

碳源是微生物胞外多糖生產(chǎn)的關(guān)鍵因素,可占總成本約63%[38]。鞘氨醇單胞菌擁有廣泛的底物譜,如最開始用作發(fā)酵威蘭膠的碳源是單糖(例如葡萄糖)。但由于碳源轉(zhuǎn)化率低,使得威蘭膠生產(chǎn)成本高價格昂貴,因此,研究、探索適合生產(chǎn)的廉價碳源:a.利用甘蔗糖蜜作為碳源,采用酸水解法處理糖蜜,發(fā)酵液中威蘭膠濃度可達(dá)33.5 g/L[36],明顯高于使用相同濃度糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)混合物發(fā)酵產(chǎn)量,因此認(rèn)為糖蜜中含氮類化合物和大量有機(jī)酸,比起單糖和雙糖更適合該菌生長;b.利用中性蛋白酶、α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶處理廚余,在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行威蘭膠發(fā)酵,威蘭膠產(chǎn)量、還原糖和氮源的利用率分別達(dá)到5.57 g/L、94.25%和61.96%[39];c.利用制糖工業(yè)廢料葡萄糖母液和木糖母液生產(chǎn)威蘭膠,先利用葡萄糖母液供給鞘氨醇單胞菌繁殖,再使用擬指數(shù)補(bǔ)料方法加入木糖母液,得到威蘭膠濃度為22.68 g/L,糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.756 g/g[16]。

3.2 氮源優(yōu)化

微生物可以利用多種氮源,它們通過酶來運(yùn)輸這些化合物和酶,并代謝產(chǎn)生氨。氮源調(diào)控旨在防止或減少細(xì)胞對酶和通透酶形成的不必要的分歧,以便在優(yōu)選氮時利用作為非谷氨酸和谷氨酰胺來源的化合物作為氮源。微生物細(xì)胞能夠靈敏地感應(yīng)出生長環(huán)境中氮源的變化并及時作出代謝調(diào)整,利于細(xì)胞存活。將六種不同的氮源NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母粉用于鞘氨醇單胞菌ATCC31555的發(fā)酵,初始氮源濃度為3 g/L,NaNO3和牛肉膏對威蘭膠的合成影響最大,發(fā)酵結(jié)束時,威蘭膠產(chǎn)量分別達(dá)到8.76和12.47 g/L,生物量分別為5.85和7.89 g/L,進(jìn)一步對這兩種氮源進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),牛肉膏比起NaNO3更適合細(xì)菌生長,NaNO3生產(chǎn)的威蘭膠粘度更大,隨著NaNO3濃度的降低,威蘭膠的分子量和甘露糖的摩爾比降低,但葡萄糖醛酸的摩爾比增加[40];與無機(jī)氮相比,有機(jī)氮的細(xì)菌生物量和威蘭膠產(chǎn)量更高,通過轉(zhuǎn)錄組分析不同氮源培養(yǎng)鞘氨醇單菌ATCC 31555代謝過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)菌趨化性變化相關(guān)聯(lián)的基因的表達(dá)水平,這些基因表達(dá)變異可能是細(xì)菌生物量和威蘭膠生產(chǎn)變化的原因[41]。

3.3 溶氧量調(diào)控策略

鞘氨醇單胞菌是一種好氧微生物,在生產(chǎn)威蘭膠這類粘性多糖的過程中,營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣轉(zhuǎn)移的效率很容易受到發(fā)酵過程中流體的高粘度的影響[42],因此,威蘭膠的合成和特性可能受到溶氧量影響。隨著生產(chǎn)時間的增加,產(chǎn)物在細(xì)胞外堆積,氧氣傳送速率降低,導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。在好氧微生物發(fā)酵的過程中,溶氧量成為限制性控制因素,氧氣傳遞速率影響整個細(xì)菌生長和生產(chǎn)代謝過程。氧氣量的減少可能導(dǎo)致酶的功能受到影響,從而導(dǎo)致所需產(chǎn)物減少甚至微生物死亡。溶氧因素的優(yōu)化方式有以下幾種:a通過改變轉(zhuǎn)速提高溶氧量。在600 r/min時將溶氧濃度增加至20%,可獲得最大威蘭膠濃度和分子量為(9.20±0.11)×105Da和(24.5±0.53) g/L,此時葡萄糖-1-磷酸對威蘭膠的通量增強(qiáng),增加的通量也可能是分子量和威蘭膠濃度增加的原因[43];使用兩階段轉(zhuǎn)速控制策略,發(fā)酵初期22 h期間,攪拌速度控制在800 r/min以維持速率的細(xì)胞生長,然后將攪拌速度逐步降低至600 r/min以保持具有穩(wěn)定溶解氧水平以獲得高產(chǎn)量,威蘭膠的最大濃度達(dá)到(26.3±0.89) g/L,產(chǎn)量為(0.53±0.003) g/g,其與恒定攪拌速度控制的最佳結(jié)果相比,產(chǎn)量增加了20.1%[44];b 通過添加氧載體提高溶氧量。與水不混溶且比水具有更高的氧氣增溶能力的有機(jī)相,通常稱為氧氣載體[45]。向發(fā)酵液加入氧載體正十二烷和正十六烷后,發(fā)酵培養(yǎng)基的氧轉(zhuǎn)移量達(dá)到顯著高于對照組,同時威蘭膠濃度和產(chǎn)率分別達(dá)到(33.9±0.56) g/L和(0.761±0.010) g/g,且添加正十二烷,菌體濃度達(dá)到最大值(7.82±0.18) g/L[37];比較十六烷基三乙基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、Triton X-100、Span-20、Span-40、Span-80、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80、DMSO和甘油的添加對產(chǎn)量的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在吐溫-40的作用下增產(chǎn)最高,威蘭膠濃度為(23.62±0.60) g/L[46]。

綜上所述,選用廉價碳源既減少了發(fā)酵成本,且適宜的廉價碳源(如糖蜜)也使得產(chǎn)量提升最為明顯,可將其與其他提產(chǎn)方式及育種方式進(jìn)行結(jié)合,研究出集最佳的菌種、培養(yǎng)基及發(fā)酵條件為一體的發(fā)酵體系。

4 威蘭膠的分離純化

從發(fā)酵液中分離多糖的最常用方法是除去菌體后用異丙醇、乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行物理萃取,再通過離心處理獲得粗多糖?？稍谌コw前使用超聲波處理或加熱充分溶解威蘭膠膠體,使菌體與威蘭膠分離[47]。粗威蘭膠中含有少量蛋白質(zhì),通常使用Sevage法脫去蛋白,之后放入透析袋中透析,以除去小分子的金屬離子及單糖等物質(zhì)。將透析后的截留液進(jìn)行真空濃縮、冷凍干燥,可制得精制的威蘭膠(圖3)。離心和過濾可用于從粗膠中除去不溶物質(zhì)并除去一定比例的高可溶性物質(zhì),透析處理可以除去更低摩爾質(zhì)量的雜質(zhì)。其他方法例如離子交換色譜、柱層析等方法也可用于多糖的純化,需要進(jìn)一步開發(fā)這些技術(shù)用于威蘭膠的純化。

圖3 威蘭膠的分離純化Fig.3 Separation and purification of Welan gum

5 結(jié)論與展望

威蘭膠這種在高溫與廣泛酸堿度中粘性穩(wěn)定的性能特殊原料,仍然集中應(yīng)用在建筑、石油等重工業(yè)領(lǐng)域,在食品行業(yè)中僅有少部分國家視其為合法的食品添加劑。與其類似的胞外多糖例如黃原膠、結(jié)冷膠等,已經(jīng)在各個工業(yè)領(lǐng)域占據(jù)一定的地位。威蘭膠普及率低的原因與其生產(chǎn)成本高有很大的關(guān)系,碳轉(zhuǎn)化率低、分離純化方法復(fù)雜等原因限制其經(jīng)濟(jì)性。近年來在合成代謝途徑、生產(chǎn)條件優(yōu)化與提高經(jīng)濟(jì)性等方面進(jìn)行了諸多研究,且有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。但較已工業(yè)化的黃原膠與結(jié)冷膠還有一定的差距,因此需要進(jìn)一步找出提高產(chǎn)量與簡易純化的方法。關(guān)于威蘭膠生產(chǎn)發(fā)展的后期研究應(yīng)圍繞以下幾個方面:更深入研究其結(jié)構(gòu)與性能,開發(fā)更多應(yīng)用潛力;與其他試劑相溶性與應(yīng)用;降低生產(chǎn)成本;開發(fā)研究其衍生物。威蘭膠生產(chǎn)應(yīng)用的研究雖然有所進(jìn)展,但仍然任重而道遠(yuǎn)。