不同品種甘薯葉提取物抗氧化及對α葡萄糖苷酶抑制活性的研究

(聊城大學農(nóng)學院,山東聊城 252000)

糖尿病是一種以高血糖和血管并發(fā)癥為特征的全球性代謝紊亂疾病。糖尿病已經(jīng)成為60歲以下人群死亡的主要原因,占全球死亡總數(shù)的9%[1]。Ⅱ型(非胰島素依賴型)糖尿病的死亡主要是由于腦血管、心血管、下肢動脈疾病等大血管并發(fā)癥導致的,其基本病理改變?yōu)閯用}粥樣硬化[2]。通過使用α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制碳水化合物消化來降低餐后高血糖是一種非常有效的糖尿病治療方法。α-葡萄糖苷酶是位于腸細胞刷狀表面膜的一種糖酶,催化低聚糖水解成單糖,促進小腸對葡萄糖的吸收[3]。有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑可以顯著延緩體內(nèi)的葡萄糖吸收,降低血糖水平[4]。多項研究表明,糖尿病人血液中的高血糖水平容易引起葡萄糖自氧化和蛋白糖基化,從而導致自由基過度生成,細胞氧化還原平衡被打破,引起氧化應激反應[5-6]。氧化應激會損害糖尿病患者胰島素的分泌和胰島素的作用,并且會促進動脈粥樣硬化的形成,引起糖尿病并發(fā)癥[7]。因此,氧化應激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。通過單純降糖治療并不能有效降低并發(fā)癥的風險,臨床上通常使用抗血小板凝集(如阿司匹林)和穩(wěn)定斑塊(如他汀類)的藥物進行干預治療[8]。然而,利用降血糖、抗血小板聚集、穩(wěn)定斑塊的藥物治療糖尿病方法都有其局限性,如阿卡波糖會引起胃腸副反應;胃潰瘍患者不能服用阿司匹林;他汀類藥物可能會對肝臟造成損害等[9-11]。因此,有必要探索并找到一些有效且安全的α-葡萄糖苷酶抑制劑和抗氧化劑來補充或替代藥物以達到預防和治療Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的療效。

研究表明,膳食中多酚的攝入能夠通過抗氧化作用抵御高血糖引起的氧化應激和抑制α-葡萄糖苷酶活性影響碳水化合物代謝,從而影響糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[12-13]。甘薯(IpomoeabatatasL.)是世界上最主要的糧食作物之一,中國是其最大的生產(chǎn)國。甘薯葉是甘薯作物的副產(chǎn)品,在世界上許多地區(qū)已被作為一種綠葉蔬菜食用,在預防炎癥、腫瘤、癌癥、心血管疾病、高血壓、高血糖和糖尿病等多種疾病方面具有一定的作用,引起了普遍關注[14-16]。據(jù)報道,甘薯葉比許多其他常見的蔬菜具有更高的多酚含量和更強的抗氧化活性[17-18]。然而,在中國甘薯葉資源開發(fā)利用程度較低,除了少部分用作蔬菜和飼料外,絕大部分被廢棄掉,造成資源的極大浪費。因此,為了開發(fā)出質(zhì)量可靠、功效可靠的甘薯葉類營養(yǎng)保健品,研究驗證甘薯葉活性成分及其生理功能具有非常重要的意義。然而,到目前為止,關于甘薯葉抗氧化活性,尤其是對抗糖尿病作用的研究報道還是比較有限。因此,本試驗通過比較7種優(yōu)質(zhì)品種甘薯葉提取物中總多酚(總黃酮)含量、DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力、還原能力以及對α-葡萄糖苷酶抑制能力來探討甘薯葉抗氧化和降血糖的功效,為甘薯資源的開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

7個甘薯品種(蘇薯8、龍薯9、濟薯18、商薯19、徐薯18、廣薯87、煙薯25)幼苗 國家甘薯種質(zhì)徐州試管苗庫,經(jīng)聊城大學農(nóng)學院植物科學教研室進行鑒定,于2018年5月種植在聊城大學試驗田中,10月進行甘薯葉采摘；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、沒食子酸(Gallic acid,GA)、蘆丁、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20) 色譜純,sigma公司;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside,PNPG)、阿卡波糖、維生素 C(Vitamin C,VC) 色譜純,阿拉丁試劑公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

L5S型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;UPW-20N型超純水機 北京歷元電子儀器有限公司;Fluosear熒光酶標儀 德國BMGLABTECH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘薯葉提取物制備 新鮮甘薯葉晾干后,用粉碎機粉碎并過60目篩,將制得的甘薯葉粉末裝入密封袋中,-20 ℃冷藏備用。本試驗用蒸餾水、60%乙醇和無水乙醇做提取溶劑。精密稱取2.00 g甘薯葉粉末,按1∶30 (m/V)加入提取溶劑,在超聲功率100 W、溫度50 ℃條件下,提取30 min,抽濾。殘渣用相同的條件再次提取,合并兩次濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,并用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中,得到甘薯葉提取物,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 總多酚和總黃酮含量測定 總多酚含量采用福林酚法[19]:取樣品各1.0 mL,于10 mL棕色容量瓶中,加入5.0 mL 10%福林酚試劑,混勻。反應3～8 min,加入4.0 mL 7.5% Na2CO3,加蒸餾水定容至10 mL,搖勻。室溫下放置60 min,765 nm測定吸光度。以(0.1～0.6 mg/mL)沒食子酸為標準品,繪制標準曲線Y=7.336X+0.151(R2=0.9991)?？偠喾雍恳詻]食子酸當量(mg GAE/g DW)表示。

總黃酮含量采用硝酸鋁顯色法[14]:取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中,各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,靜止放置6 min,加10%硝酸鋁溶液0.3 mL,混合均勻,靜止放置6 min,加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,再用70%乙醇溶液稀釋至刻度線,靜止放置15 min后,分別在510 nm處測定其吸光度。以(0.01～0.06 mg/mL)蘆丁為標準品,繪制標準曲線Y=11.464 X+0.0141(R2=0.9994)?？傸S酮含量以蘆丁當量(mg RE/g DW)表示。

1.2.3 DPPH·清除能力測定 取樣品0.2 mL及3.8 mL 0.025 mmo1/L的DPPH溶液加入試管中,搖勻后放置30 min,測定517 nm處的吸光度A1。同時測定無水乙醇代替DPPH時的吸光度A2,用蒸餾水代替樣品時的吸光度A0。由公式1計算DPPH·的抑制率。

式(1)

采用VC作陽性對照,甘薯葉清除DPPH·能力以VC當量(mg VCE/g DW)表示。

我國農(nóng)業(yè)已經(jīng)開始向信息化發(fā)展，但在萬州區(qū)的農(nóng)村地區(qū)，信息管理系統(tǒng)仍不完善，服務質(zhì)量低，阻礙了農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展。農(nóng)業(yè)市場信息傳播不及時、農(nóng)民思想觀念落后、缺乏專業(yè)的培訓教育等，使得農(nóng)業(yè)信息化發(fā)展緩慢。先進的生產(chǎn)技術不能被高效利用和不能及時了解市場信息作出正確決策，導致了我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率和生產(chǎn)效益低下。

1.2.4 ABTS自由基清除能力測定 先將0.89 mL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液加入到50 mL 7 mmol/L ABTS溶液中,過夜,4 ℃下保存,制備成為ABTS儲備液。臨用前將ABTS儲備液進行稀釋,在734 nm下使其吸光值在0.70±0.02,制成ABTS工作液。將0.1 mL樣品加入到1.9 mL的ABTS工作液中,充分混勻,避光反應6 min后在734 nm下測定吸光值A1,同時測定蒸餾水代替ABTS時的吸光度A2,用蒸餾水代替樣品時的吸光度A0。由式(1)計算ABTS自由基的抑制率。VC作陽性對照,甘薯葉清除ABTS自由基能力以VC當量(mg VCE/g DW)表示。

1.2.5 羥自由基(·OH)清除能力測定 反應體系由 0.5 mL的8 mmol/L FeSO4,0.8 mL的6 mmol/L H2O2,0.5 mL蒸餾水,1 mL不同濃度的試樣及0.2 mL的20 mmol/L水楊酸鈉組成。反應體系在37 ℃下反應1 h,562 nm下測定吸光值A1,同時測定蒸餾水代替水楊酸時的吸光度A2,用蒸餾水代替樣品時的吸光度A0。由式(1)計算OH·的抑制率。VC作陽性對照,甘薯葉清除OH·能力以VC當量(mg VCE/g DW)表示。

1.2.6 還原能力測定 取1 mL樣品于試管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH6.6)和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃水浴保溫20 min后,快速冷卻,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸,5000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵,充分混勻,在700 nm下測其吸光度,試樣還原能力以吸光值表示。VC作陽性對照,甘薯葉的還原能力以VC當量(mg VCE/g DW)表示。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制能力測定 96孔板中加入磷酸鉀緩沖液(pH6.8)100 μL、20%二甲基亞砜溶解的樣品20 μL、2.5 mmol/L PNPG 20 μL,37 ℃恒溫孵育15 min后加入0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶20 μL,37 ℃恒溫反應15 min。再加入80 μL濃度為0.2 mol/L的Na2CO3溶液,于405 nm波長處測定吸光度值A1。蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶時的吸光度A2,用蒸餾水代替樣品時的吸光度A0。由式(1)計算α-葡萄糖苷酶抑制率。阿卡波糖作陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次,結果表示為平均值±標準差。利用Minitab 17.0軟件進行單因素方差分析,利用Pearson進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種甘薯葉總多酚和總黃酮含量分析

總多酚含量測定采用福林酚法,其結果以沒食子酸當量表示(表1、表2)。3種不同極性提取溶劑對總多酚和總黃酮含量影響的結果表明(表1、表2),乙醇提取物顯著高于水提取物(P<0.05),其含量高低依次為60%乙醇提取物>100%乙醇提取物>水提取物。在一些甘薯品種(蘇薯8、廣薯87和煙薯25)中60%乙醇提取物和100%乙醇提取物中總多酚和總黃酮含量在統(tǒng)計學上無明顯差異(P>0.05)。Metrouh-Amir等指出,所用溶劑的極性以及被測材料中的化學成分對提取物的得率有很大影響[19]。不同品種甘薯葉提取物的總多酚和總黃酮含量具有相同的趨勢,說明甘薯葉中多酚和黃酮的極性更接近60%乙醇,這與田燕楠等研究結果一致[20]。3種溶劑對比,水提取物中總多酚和總黃酮的含量最低,這可能與提取材料中蛋白質(zhì)和碳水化合物等其他組分溶解度的增加有關。Do等也觀察到類似的趨勢,乙醇水溶液的水比例增加降低了紫蘇黃酮的提取效率[21]。從提取得率、溶劑殘留和經(jīng)濟性角度綜合分析,60%乙醇可作為甘薯葉總多酚和總黃酮的最佳提取溶劑。

表1 7個品種甘薯葉不同溶劑提取物的總多酚含量Table 1 Total polyphenols contents of leaves extracts of different solvents from seven kinds of sweet potato

表2 7個品種甘薯葉不同溶劑提取物的總黃酮含量Table 2 Total flavonoids contents of leaves extracts of different solvents from seven kinds of sweet potato

7個甘薯品種60%乙醇提取物總多酚含量介于15.02～33.33 mg GAE/g DW,其含量高低依次為徐薯18>濟薯18>龍薯9>商薯19>廣薯87>煙薯25>蘇薯8,其中含量最高的3個品種為徐薯18、濟薯18和龍薯9,且無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。7種甘薯品種60%乙醇提取物總黃酮變化趨勢與總多酚相似,含量介于1.06～3.11 mg RE/g DW,其含量高低依次為濟薯18>龍薯9>徐薯18>商薯19>廣薯87>煙薯25>蘇薯15,其中含量最高的3個品種為龍薯9、濟薯18和徐薯18,且無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果提示龍薯9、濟薯18和徐薯18 3個品種甘薯葉是多酚的潛在優(yōu)勢來源。

2.2 抗氧化活性

圖1 不同品種甘薯葉提取物抗氧化活性對比Fig.1 Antioxidant activity of leaves extract of different kinds of sweet potato注:(A)DPPH·清除能力;(B)ABTS+·清除能力;(C)·OH清除能力;(D)還原能力。不同字母表示差異顯著,P<0.05;圖2同。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用體外酶活測定進一步評價7種甘薯葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性(圖2)。α-葡萄糖苷酶抑制活性存在劑量依賴關系,未稀釋的樣品對α-葡萄糖苷酶抑制率介于31.08%～52.83%。7個甘薯品種α-葡萄糖苷酶抑制活性高低依次為商薯19>龍薯9>濟薯18>徐薯18>廣薯87>煙薯25>蘇薯8。與陽性對照阿卡波糖對比,商薯19抑制α-葡萄糖苷酶活性相當于3.39 mg/mL阿卡波糖,而蘇薯8相當于1.86 mg/mL阿卡波糖。

圖2 不同品種甘薯葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制能力對比Fig.2 α-glucosidase inhibitory activity of leaves extract of different kinds of sweet potato

2.4 相關性分析

不同品種甘薯葉提取物抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性與其總多酚、總黃酮含量的相關性分析結果見表3。甘薯葉提取物總多酚和總黃酮含量與抗氧化活性(DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力和還原能力)均呈極顯著正相關性(P<0.01),但與α-葡萄糖苷酶抑制活性無顯著相關性(P>0.05)。結果提示多酚(黃酮)是甘薯葉片中重要的抗氧化劑,其含量的高低可以直接反映抗氧化活性的強弱。而α-葡萄糖苷酶抑制活性不僅取決于多酚(黃酮)含量,也可能與其他活性成分(如多糖或有機酸)有關[22]。研究表明多酚(黃酮)結構中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結構,使其具有較強清除自由基的能力和抗氧化活性,并且抗氧化活性強弱與其含量的高低、種類、結構、酚羥基數(shù)量和位置有關[1,14]。

表3 甘薯葉活性成分(總多酚和總黃酮)與抗氧化、α-葡萄糖苷酶的抑制活性的相關性Table 3 The relationships of the contents of total polyphenols and total flavonoids with the antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory activity of sweet potato leaves

3 討論

本研究顯示,7個品種甘薯葉均含有豐富的多酚和相對較低黃酮類物質(zhì),總多酚含量介于15.02～33.33 mg GAE/g DW,總黃酮含量介于1.06～3.11 mg RE/g DW。這與Fu等對甘薯葉多酚和黃酮的研究結果一致,其結果顯示甘薯葉總多酚含量介于23.3～43.8 mg CAE/g DW,總黃酮含量介于0.6～3.4 mg QE/g DW[23]。多酚是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物,是決定水果、蔬菜等植物感官和營養(yǎng)品質(zhì)的重要因素,由于具有較高的抗氧化能力,隨飲食攝入后有益于身體健康[24]。Pérez-Jiménez等對24種常見的食用蔬菜和水果(蘋果、香蕉、橘子、梨、桃、葡萄、柑橘、西瓜、甜瓜、土豆、胡蘿卜、生菜、四季豆、菊苣、西葫蘆、洋蔥、甘藍、西藍花、青椒、蘆筍、甜菜、紅菜根和菠菜)中抗氧化劑的含量和結構進行研究,報道顯示24種蔬菜和水果中總多酚含量的平均值為(591.5±320.1) mg/100 g干重[24]。通過與該研究結果對比,發(fā)現(xiàn)甘薯葉中總多酚的含量高于普通的蔬菜和水果,甚至高于含量最高的蔬菜類青椒(1834.4±186.9 mg/100 g 干重)和含量最高的水果類葡萄(1870.0±192.0 mg/100 g干重)。這與Sun等人的研究結果相一致,Sun指出甘薯葉中多酚含量是一些普通蔬菜(如菠菜、甘藍)的2～3倍,因此無論甘薯葉作為蔬菜食用或作為多酚物質(zhì)來源都具有較強的優(yōu)勢[25]。一些研究表明,不同品種植物中多酚含量具有差異,可能與多酚氧化酶活性、成熟度、采后加工方式、基因型、貯藏條件和營養(yǎng)成分等因素有關[25-27]。本研究所選的甘薯品種統(tǒng)一進行種植和采收,并采用相同的采后加工方式和貯藏條件,因此甘薯葉多酚含量存在差異可能主要受基因型(遺傳因素)的影響。

多酚是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎,而黃酮主要是植物為抵抗環(huán)境脅迫產(chǎn)生的一類多酚類化合物[28-29]。本研究結果顯示甘薯葉提取物均具有良好的抗氧化活性,且與總多酚和總黃酮含量相關性顯著。席利莎等對甘薯莖葉多酚的體外抗氧化活性與加工穩(wěn)定性研究中表示,甘薯莖葉多酚具有良好的抗氧化活性,其DPPH·清除能力、·OH清除能力、還原能力、超氧陰離子清除能力和氧自由基吸收能力都高于茶多酚和葡萄籽多酚[30]。一些研究表明,甘薯葉多酚主要以酚酸和黃酮為主,其中酚酸類成分主要包括咖啡酸、綠原酸、反式-咖啡酸、3,4-二-反式-咖啡酞奎尼酸、4,5-二-反式-咖啡酞奎尼酸、3,5-二-反式-咖啡酸奎尼酸和3,4,5-三-反式-咖啡酞奎尼酸;黃酮類成分主要包括槲皮素、槲皮素甙(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)、4,7-二甲氧基山奈酚和3,4,7-三甲氧基槲皮素[1,14,31-33]。酚羥基是多酚類物質(zhì)起抗氧化功能的主要官能基團。Zhang等和Islam等也指出多酚是甘薯葉中主要的抗氧化劑,且多酚結構與抗氧化活性密切相關,酚羥基數(shù)量越多,奎尼酸咖啡?；潭仍礁?黃酮甲氧化程度越低,抗氧化活性越強[1,14,31]。甘薯葉多酚可以提供氫原子穩(wěn)定DPPH·和ABTS+·、捐贈電子減少Fe3+還原和螯合Fe2+抑制·OH的生成。本試驗7個品種甘薯樣品的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和還原能力3個指標基本具有相同的變化趨勢,但OH·清除能力的變化趨勢有所差異,這可能是由于這四種抗氧化活性測定方法所依賴的機理不同造成的。前三個抗氧化指標關系到抗氧化劑提供氫原子和電子能力,而·OH清除能力依賴于抗氧化劑螯合金屬離子的能力[34]。Fu等對不同溶劑甘薯葉提取物的抗氧化活性進行研究時和Singh等對木藍提取物的抗氧化活性進行研究時也發(fā)現(xiàn)了類似的結果[23,35]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可以競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性,從而減緩淀粉和蔗糖等向葡萄糖的轉(zhuǎn)化,延緩腸道碳水化合物的吸收,進而達到降低血糖的目的[36]。研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物多酚、多肽、多糖和萜類化合物都具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中一些物質(zhì)甚至優(yōu)于標準的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖[4]。本實驗發(fā)現(xiàn),甘薯葉提取物可以顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性,但與多酚和黃酮含量無顯著相關性(P>0.05)。表明甘薯葉提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性不僅取決于多酚和黃酮含量,也可能與其他活性成分(如多糖或有機酸)有關。張彧等研究發(fā)現(xiàn)甘薯蔓黃酮和多糖對α-葡萄糖苷酶均具有抑制活性,且黃酮的抑制能力比多糖強[37]。高蔭榆等在動物實驗模型中發(fā)現(xiàn)甘薯葉黃酮對四氧嘧啶致糖尿病小鼠具有明顯的降血糖作用,說明抑制α-葡萄糖苷酶活性并不是甘薯葉降血糖作用的唯一原因,還有可能與促進肝糖原的合成,改善糖尿病的脂質(zhì)代謝及胰島β細胞的分泌功能等影響因素有關[38]。

4 結論

本試驗對7個優(yōu)質(zhì)品種的甘薯葉進行多酚類物質(zhì)含量和生理活性進行研究,旨在開發(fā)以多酚類化合物為主要活性成分的非食品類保健品,特別是針對糖尿病患者的保健品。結果表明,不同品種的甘薯葉均具有較強的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性,只是各評價指標檢測結果存在一定差異。徐薯18、濟薯18和龍薯9甘薯葉總多酚和總黃酮含量最高;龍薯9自由基(DPPH·、ABTS+·、·OH)清除能力最強;濟薯18還原能力最強;商薯19抑制α-葡萄糖苷酶活性最強。由此可知,龍薯9和濟薯18兩個品種甘薯葉具有較高的多酚含量和抗氧化活性,可作為優(yōu)質(zhì)抗氧化劑的資源;而商薯19甘薯葉可以作為潛在降血糖的原料。本研究結果對甘薯種植和生產(chǎn)中的品種選擇,特別是在食品藥品工業(yè)中的潛在應用具有一定的參考價值。然而,甘薯葉提取物在動物模型中的抗氧化能力、安全性評價和毒理學研究還有待進一步深入。