乙醇熏蒸處理對(duì)中華獼猴桃生理代謝及貯藏品質(zhì)的影響

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(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116600; 2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch),別名藤梨、羊桃等,屬于獼猴桃科,獼猴桃屬[1]。中華獼猴桃是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的木質(zhì)藤本植物。獼猴桃果實(shí)中含有多種維生素(維生素C等)和豐富的礦物質(zhì)(包括鈣、磷、鐵等),還含有胡蘿卜素、黃酮等物質(zhì),具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,有“水果之王”、“VC之冠”的美譽(yù)。中華獼猴桃作為中國(guó)特有的一個(gè)品種,其根部具有較高的藥用價(jià)值,研究表明中華獼猴桃根部提取出的三萜類化合物具有顯著的抗腫瘤效果[2],其果實(shí)對(duì)某些癌癥和心血管疾病具有預(yù)防的作用[3],具有一定的保健功效。中華獼猴桃不僅口感酸甜,且果肉多汁而鮮嫩,風(fēng)味極佳,香氣宜人,因此成為廣大消費(fèi)者最喜愛(ài)的水果之一。中華獼猴桃除鮮食之外,還可以進(jìn)行加工,如制成復(fù)合營(yíng)養(yǎng)飲料及果醋、特色果酒、果脯、果醬、糖類、罐頭等[4-5]。但是由于中華獼猴桃是一種多汁漿果,同時(shí)也是典型的呼吸躍變型果實(shí),有明顯的生理后熟過(guò)程,采后容易變軟腐爛,因此研究中華獼猴桃果實(shí)采后貯藏保鮮技術(shù)極為重要。

乙醇是一種便宜且常見(jiàn)的食品添加劑,已被美國(guó)食品和藥物管理局列為通用認(rèn)可的安全物質(zhì)[6]。乙醇不僅是一種很好的防腐劑,而且還具有延緩植物器官成熟和衰老的功能[7]。相關(guān)研究表明,適當(dāng)濃度外源乙醇處理能夠減少果蔬病害以及果蔬衰老;采后西蘭花經(jīng)過(guò)乙醇蒸汽處理,抑制葉綠素分解代謝的酶的活性和基因表達(dá),使西蘭花延遲變黃[8]。使用乙醇熏蒸處理鮮切茄子,通過(guò)減緩茄子呼吸速率、降低酶活性、保持細(xì)胞的完整性達(dá)到對(duì)鮮切茄子的保鮮作用[9]。乙醇還有抑制真菌的作用,將乙醇應(yīng)用到葡萄保鮮中,通過(guò)對(duì)灰霉病的防控作用,達(dá)到對(duì)葡萄的保鮮作用[10]。而乙醇熏蒸處理對(duì)獼猴桃生理代謝及品質(zhì)的影響尚未有報(bào)道。本研究通過(guò)使用不同濃度的乙醇熏蒸處理,分析其生理代謝及品質(zhì)的變化,探究最佳的乙醇熏蒸劑量和方法,以期能夠?yàn)榻窈蟮牟珊螳J猴桃貯藏提供一個(gè)安全、操作簡(jiǎn)單且成本相對(duì)低廉的新型技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮的中華獼猴桃 采購(gòu)于大連開(kāi)發(fā)區(qū)樂(lè)購(gòu)超市,挑選大小均勻一致、無(wú)機(jī)械傷害、無(wú)病蟲(chóng)害、單果重量在75～85 g的中華獼猴桃,采購(gòu)當(dāng)日即入冷庫(kù),于(0±1) ℃下貯藏;草酸、2,6-二氯酚靛酚、抗壞血酸、丙酮、碳酸鈣、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過(guò)氧化氫、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、鹽酸 均購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

CR-400型色差計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司;TA_XT plus質(zhì)構(gòu)儀 北京瑞利分析儀器有限公司;T-25型勻漿機(jī) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;AL240型電子分析天平 日本島津公司;GC-2010型氣相色譜儀 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-2600型紫外分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BR4i臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi;PAL-1 型數(shù)字手持袖珍折射儀 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 尤尼柯上海儀器有限公司;UV-2100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理方法 將中華獼猴桃分成四組,每組24個(gè),分別放入含有0、250、500、1000 μL/L乙醇的干燥器(4 L)中,置于(0±1) ℃冷庫(kù)中進(jìn)行熏蒸處理,熏蒸24 h,通風(fēng)1 h,再分別將四組中華獼猴桃每四個(gè)一組裝入密封PE保鮮袋中,(0±1) ℃貯藏。測(cè)定獼猴桃第0、14、28、42、 56、70 d中華獼猴桃生理代謝及品質(zhì)指標(biāo)。

1.2.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 硬度測(cè)定 使用TA_XT plus質(zhì)構(gòu)儀,探頭使用P/5探頭,根據(jù)探頭刺入果實(shí)后的最大力來(lái)測(cè)定它的硬度,即第一次刺入時(shí)的最大峰值。每次重復(fù)測(cè)定至少3個(gè)果實(shí)。

1.2.2.2 呼吸強(qiáng)度測(cè)定 參照司琦等[11]的方法,稍作改動(dòng),先將經(jīng)過(guò)四種濃度熏蒸處理的中華獼猴桃分別稱取200 g放入密封塑料盒中,在0 ℃冷庫(kù)靜置呼吸1 h。然后搖晃塑料盒,使其內(nèi)部氣體分散均勻。接著用GC-2010型氣相色譜儀經(jīng)色譜儀檢測(cè)后得到色譜圖,通過(guò)峰面積可得到進(jìn)樣氣體CO2的體積分?jǐn)?shù)(%),最后推算出呼吸速率。

1.2.2.3 可溶性固形物(TSS)含量測(cè)定 使用PAL-1便攜式手持折光儀進(jìn)行測(cè)定,取5 g中華獼猴桃果肉,放入研缽中研磨至磨碎后,經(jīng)離心(4000 r/min,10 min),取汁液測(cè)定。

1.2.2.4 葉綠素含量的測(cè)定 參照任紅等[12]的方法,稱取1.0 g中華獼猴桃果肉樣品放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3 mL 80%丙酮溶液,研成勻漿,再加10 mL 80%丙酮溶液繼續(xù)研磨至組織變白,靜置3～5 min提取;然后過(guò)濾到50 mL棕色容量瓶中;最后用80%丙酮溶液定容至50 mL,搖勻。注意,各器皿、用具在使用之前必須用80%丙酮溶液潤(rùn)洗。以80%丙酮溶液為空白參比調(diào)零,用1 cm光徑比色皿在波長(zhǎng)663 nm和645 nm處分別比色測(cè)定提取液的吸光度值。

葉綠素含量(mg/g)=[(20.29×OD645+8.05×OD663)×6]/(m×1000)

1.2.2.5 果肉顏色飽和度 用CR-400型色差計(jì)測(cè)定其橫切面的色澤,測(cè)定方法參照姜愛(ài)麗等[13]的方法,每次至少取三個(gè)進(jìn)行測(cè)定,取平均值。

1.2.2.6 PPO、POD、CAT 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)的測(cè)定方法參照Chen等[14]、Marsellés-Fontanet等[15]的方法,稍作改動(dòng)形成本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方法。過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)的測(cè)定方法參照Cakmak等[16]的方法稍作改動(dòng),然后測(cè)定其酶活力。分別測(cè)定1 min內(nèi)每克果實(shí)在398、460、290 nm處吸光度,結(jié)果以U表示,重復(fù)3次。

1.2.2.7 總酚、類黃酮含量測(cè)定 采用HCl-甲醇法[17],稱取2.0 g中華獼猴桃果肉,加入少許經(jīng)預(yù)冷的1% HCl-甲醇溶液,在冰浴條件下研磨,然后轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中。用1% HCl-甲醇溶液漂洗,漂洗后一并轉(zhuǎn)移到試管中,于4 ℃避光條件下提取20 min,收集濾液待用。以1% HCl-甲醇溶液做空白參比調(diào)零,取濾液于280、325 nm測(cè)定溶液吸光值。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=0.0051x+0.0178(R2=0.995),計(jì)算總酚含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=11.105x-0.0021(R2=0.9998),計(jì)算類黃酮含量。

1.2.2.8 抗壞血酸 采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[18]。用已標(biāo)定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定用草酸提取的果實(shí)上清液(搖勻后靜置提取10 min,過(guò)濾),至出現(xiàn)微紅色、且15 s不褪色為止,記下染料的用量,重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實(shí)驗(yàn)均需進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),用Excel計(jì)算數(shù)據(jù)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差,并用Origin 8做圖,SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇熏蒸處理對(duì)中華獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的影響

呼吸作用是果蔬采后生命活動(dòng)的中心,與其品質(zhì)變化、采后生理變化以及貨架期有著較為密切的聯(lián)系[19]。如圖1A所示,對(duì)照的呼吸強(qiáng)度呈先上升后下降的趨勢(shì),42 d時(shí)達(dá)到最高峰。而經(jīng)過(guò)乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃的呼吸強(qiáng)度受到明顯的抑制,其中250 μL/L乙醇熏蒸處理對(duì)中華獼猴桃呼吸作用的抑制程度優(yōu)于500與1000 μL/L乙醇熏蒸處理,呼吸強(qiáng)度顯著低于這兩組乙醇處理(P<0.05)。采后果蔬在貯藏前期的新鮮度較好,品質(zhì)較優(yōu),呼吸速率低;貯藏中期呼吸速率開(kāi)始升高,表明采后果蔬正在逐漸衰老變質(zhì);而貯藏后期呼吸速率又下降,表明此時(shí)采后果蔬已完全干枯或腐爛,臨近衰老死亡狀態(tài)[20-21]。

圖1 乙醇熏蒸處理中華獼猴桃果實(shí)對(duì)呼吸強(qiáng)度(A)、果實(shí)硬度(B)、葉綠素含量(C)、可溶性固形物含量(D)、果肉顏色飽和度(E)的影響Fig.1 Effects of ethanol fumigation treatment on the respiratory rate(A),fruit firmness(B),chlorophyll content(C),TSS(D)and the saturation of flesh color(E)in Chinese kiwi fruit

果實(shí)硬度是衡量果實(shí)成熟度和貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,如圖1B所示,在貯藏期間,四種處理?xiàng)l件下果實(shí)硬度均呈逐漸下降的趨勢(shì),250 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃硬度顯著高于同期對(duì)照(P<0.05)。500 μL/L乙醇處理的中華獼猴桃果實(shí)硬度在第42 d時(shí)的果實(shí)硬度接近于1000 μL/L乙醇處理的中華獼猴桃。在果實(shí)成熟、衰老過(guò)程中,果實(shí)硬度逐漸降低[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇熏蒸處理有利于保持果實(shí)硬度,減緩果實(shí)的軟化速率。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素物質(zhì)。在水果、蔬菜中也存在著大量的葉綠素。如圖1C所示,對(duì)照的中華獼猴桃中葉綠素含量呈下降趨勢(shì),而經(jīng)乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃中葉綠素的含量是呈緩慢上升后又下降的趨勢(shì),并且250、500與1000 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)中葉綠素含量分解速率差異不顯著,在第14～28 d內(nèi)高于同期對(duì)照。Sukanya等[23]對(duì)西蘭花的研究表明,采后初期,由于有脫鎂葉綠素生成,果實(shí)中葉綠素值升高,一段時(shí)間后,隨著果蔬成熟衰老,葉綠素含量不斷下降。

如圖1D所示,中華獼猴桃果實(shí)中可溶性固形物含量在貯藏過(guò)程中均呈上升趨勢(shì),在第14～42 d,乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃可溶性固形物含量低于同期對(duì)照,且在第70 d時(shí),250與500 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)的可溶性固形物含量差異不顯著(P>0.05)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),果蔬中的淀粉分解轉(zhuǎn)化為可溶性糖,隨之可溶性固形物含量也將增加[24-25]。

果肉顏色飽和度的變化是中華獼猴桃品質(zhì)變化最直觀的表現(xiàn),隨著貯藏天數(shù)的延長(zhǎng)，大多數(shù)果蔬的果肉顏色飽和度都會(huì)發(fā)生一個(gè)明顯下降的趨勢(shì)。如圖1E所示,四種處理?xiàng)l件下果肉顏色飽和度均呈逐漸下降的趨勢(shì),在第42 d,經(jīng)過(guò)500 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果肉顏色高于同期對(duì)照,在第56、70 d,乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果肉顏色飽和度差異不顯著(P>0.05),但均高于同期對(duì)照。

2.2 不同濃度乙醇熏蒸處理對(duì)中華獼猴桃果實(shí)酶活性的影響

如圖2A所示,果實(shí)大部分的CAT活性呈現(xiàn)先下降,后升高又下降的趨勢(shì)。CAT活性高峰總體出現(xiàn)在第56 d,乙醇熏蒸處理后,CAT活性高于同期對(duì)照,在第28 d前,250 μL/L乙醇熏蒸處理顯著高于其他處理組(P<0.05),在第42、56 d,1000 μL/L乙醇熏蒸處理效果最佳,第70 d,三種乙醇熏蒸處理差異不顯著(P>0.05),但均高于同期對(duì)照。當(dāng)果蔬中的活性氧積累過(guò)多而不能及時(shí)清除時(shí),果蔬的衰老速度將加快。CAT能夠催化果蔬體內(nèi)積累的過(guò)氧化氫(H2O2),從而減少H2O2對(duì)果蔬帶來(lái)的氧化損傷[26]。

如圖2B所示,在第56 d時(shí)PPO活性最高,在第56 d,500 μL/L乙醇處理的中華獼猴桃活性高峰顯著低于同期對(duì)照(P<0.05),前28 d時(shí)PPO活性差異不顯著(P>0.05)，乙醇熏蒸處理對(duì)PPO活性影響不顯著。多酚氧化酶是一種以銅為輔機(jī)的酶,PPO將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì),醌類化合物進(jìn)一步聚合形成褐色、棕色和黑色聚合物,果蔬出現(xiàn)的組織褐變與組織中的多酚氧化酶活性密切相關(guān)[27]。Rocha等[28]的研究表明,切割后萵苣和蘋果的PPO酶活性顯著升高,且有明顯的褐變現(xiàn)象。

圖2 乙醇熏蒸處理中華獼猴桃果實(shí)對(duì)CAT活性(A)、PPO活性(B)、POD(C)活性的影響Fig.2 Effect of ethanol fumigation treatment on the CAT(A),PPO(B),and POD(C)activity of Chinese kiwi fruit

如圖2C所示,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,中華獼猴桃POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。第14 d時(shí)，處理組顯著高于同期對(duì)照(P<0.05),第70 d時(shí)各組果實(shí)POD活性沒(méi)有太大差異(P>0.05)。由此可見(jiàn),乙醇熏蒸處理不能夠降低POD活性。POD是果蔬體內(nèi)普遍一種重要的氧化還原酶,它與果蔬的許多生理代謝過(guò)程密切相關(guān),具有很強(qiáng)的抗性(抗病、抗氧化、抗逆境脅迫等)。POD在有H2O2存在的條件下,POD能夠使酚類和黃酮類氧化,再聚合,從而形成褐色物質(zhì),導(dǎo)致果蔬褐變[27,29]。Aquino-Bolaos[30]提出PPO和POD有著促進(jìn)褐變的作用。

2.3 不同濃度乙醇熏蒸處理對(duì)中華獼猴桃果實(shí)抗氧化物質(zhì)的影響

如圖3A所示,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,中華獼猴桃果實(shí)中維生素C的含量呈下降趨勢(shì),經(jīng)過(guò)乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)中維生素C含量顯著高于同期對(duì)照(P<0.05)。在第14 d時(shí),250與1000 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)維生素C含量顯著高于(P<0.05)500 μL/L乙醇熏蒸處理組,在第28 d,三種乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)維生素C含量差異不顯著(P>0.05),在第28 d,250 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)維生素C含量顯著高于(P<0.01)同期對(duì)照。中華獼猴桃中含有豐富的維生素C,VC具有很強(qiáng)的抗氧化能力,所以是重要的抗氧化性物質(zhì)之一,其抗氧化性與其含量呈正比例[31]，在果蔬衰老過(guò)程中起抗氧化劑的作用。

如圖3B所示,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,中華獼猴桃果實(shí)總酚含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),乙醇處理組第28 d達(dá)到峰值,500 μL/L乙醇熏蒸處理的效果最顯著,在第42 d前,乙醇熏蒸處理中華獼猴桃總酚含量明顯高于同期對(duì)照。第56 d時(shí)乙醇處理的中華獼猴桃總酚含量差異不顯著(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙醇處理可減緩中華獼猴桃中總酚含量的下降速率。

圖3 乙醇熏蒸處理中華獼猴桃果實(shí)對(duì)抗壞血酸(A)、總酚含量(B)、類黃酮含量(C)的影響Fig.3 Effect of ethanol fumigation treatment on the vitamin content C(A),phenol compounds(B)and flavonoids content(C)in Chinese kiwi fruit

如圖3C所示,中華獼猴桃果實(shí)中的類黃酮含量呈先上升后下降的趨勢(shì),第42 d時(shí)達(dá)到峰值,乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃果實(shí)的類黃酮含量顯著高于同期對(duì)照(P<0.05),在第42 d前,500 μL/L乙醇熏蒸處理的中華獼猴桃類黃酮含量顯著高于同期對(duì)照(P<0.05)。第56、70 d的類黃酮含量差異性不顯著(P>0.05)。果蔬組織中大量存在著酚類、類黃酮類和花青素等植物次生代謝產(chǎn)物,它們與果蔬的色澤發(fā)育、品質(zhì)和風(fēng)味形成、成熟衰老過(guò)程、組織褐變、抗逆性和抗病性代謝等作用密切相關(guān),對(duì)果蔬的貯藏有重要的影響[32]。

2.4 主成分分析

主成分分析法(PCA)是將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)的降維統(tǒng)計(jì)分析方法[33-34],更利于人們對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。如圖4所示,將11個(gè)原始指標(biāo)綜合為三個(gè)主成分PC1、PC2和PC3,這三個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別占數(shù)據(jù)集總方差的46.343%、22.984%和11.784%(所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化),累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到81.114%。第一主成分與葉綠素含量、果肉顏色飽和度、維生素C含量和果實(shí)硬度呈正相關(guān),與可溶性固形物呈負(fù)相關(guān);第二主成分與PPO、總酚和黃酮呈正相關(guān);第三主成分與CAT呈正相關(guān)。由這些相關(guān)性可知,當(dāng)果實(shí)硬度下降,其果實(shí)品質(zhì)也下降,所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降;PPO活性能夠影響總酚和類黃酮的含量;CAT能夠催化果蔬體內(nèi)積累的過(guò)氧化氫(H2O2),降低POD與過(guò)氧化氫作用,減少因酚類和黃酮類氧化再聚合而形成的褐色物質(zhì)[35]從而較好地保護(hù)了中華獼猴桃果實(shí)品質(zhì)。

圖4 主成分分析載荷圖Fig.4 Principal component analysis loading map

3 結(jié)論

本研究使用不同濃度乙醇熏蒸處理獼猴桃果實(shí),通過(guò)相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定與分析,250和500 μL/L乙醇熏蒸處理均能能夠較好的抑制呼吸強(qiáng)度,保持果實(shí)硬度,減緩VC下降速率;其中500 μL/L乙醇熏蒸處理能夠較好的降低PPO、POD的酶活性,較好地保持果肉顏色飽和度、總酚和黃酮的含量;而1000 μL/L乙醇熏蒸處理對(duì)獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的保持未顯示出較明顯的作用。綜合考慮認(rèn)為500 μL/L乙醇熏蒸處理為最佳處理組。

以上結(jié)果表明,使用適當(dāng)濃度的乙醇熏蒸處理保持果實(shí)固有品質(zhì)以及酶活性,從而延長(zhǎng)果實(shí)的貯藏期,同時(shí)保證食用的安全性,因而乙醇熏蒸處理在獼猴桃果實(shí)保鮮中具有較好的應(yīng)用前景。但是經(jīng)過(guò)乙醇熏蒸處理對(duì)獼猴桃衰老代謝的調(diào)控途徑、抗氧化代謝途徑以及相關(guān)代謝基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚,所以仍需要進(jìn)一步的研究。