改良比色法檢測(cè)食品中的亞硝酸鹽

苗攀登,劉鐘棟

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)

亞硝酸鹽是一種很常見(jiàn)的食品添加劑和天然衍生物[1],在香腸、果醬、腌制品、肉脯等食品中都有不同劑量的添加,主要是起著色和防腐的作用。亞硝酸鹽是劇毒物質(zhì),其成人中毒劑量為0.2～0.5 g,致死劑量為3 g。在胃酸等環(huán)境下亞硝酸鹽與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺,它有極強(qiáng)的致癌作用。亞硝酸鹽還能使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,因而失去攜氧能力而引起組織缺氧。此外,亞硝胺還能夠透過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi),對(duì)胎兒有致畸作用。6個(gè)月以內(nèi)的嬰兒對(duì)亞硝酸鹽特別敏感,臨床上患“高鐵血紅蛋白癥”的嬰兒即是食用亞硝酸鹽濃度高的食品引起的,癥狀為缺氧,出現(xiàn)紫紺,甚至死亡[2-4]。

食品在生產(chǎn)、銷售等過(guò)程中,均存在著各種各樣的安全隱患,其中亞硝酸鹽超標(biāo)是一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題。亞硝酸鹽的危害無(wú)需贅述,所以詳細(xì)記錄低值食品原料中的亞硝酸鹽含量的變化,是控制亞硝酸鹽含量的必要手段?，F(xiàn)階段的檢測(cè)手段有光度法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、色譜法、毛細(xì)管電泳法。最常見(jiàn)的光度法即是比色法,其原理是:在酸性環(huán)境下,對(duì)氨基苯磺酸首先與亞硝酸根反應(yīng)生成重氮化合物,然后再與N-(1-萘基)-乙二胺發(fā)生偶合反應(yīng),形成紫紅色偶氮化合物,在540 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收且與亞硝酸鹽含量呈正相關(guān),檢測(cè)限為0.06 μg/mL。此方法已經(jīng)非常成熟、重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,但步驟繁雜,易受其它雜質(zhì)干擾,試劑毒性較大,也鑒于其檢測(cè)限的限制,近些年逐步被離子色譜法取代[5-9]。化學(xué)發(fā)光法的原理是根據(jù)亞硝酸鹽濃度與分子發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系,通過(guò)檢測(cè)分子發(fā)光強(qiáng)度來(lái)得到亞硝酸鹽的濃度。此方法具有操作方便靈敏度高、試劑消耗少、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),但也有實(shí)驗(yàn)儀器昂貴、操作人員專業(yè)要求高、工作環(huán)境要求高等缺陷[10-11]。電化學(xué)方法中常見(jiàn)的極譜法,是利用電解過(guò)程中所得到的極化電極的電流電位曲線來(lái)確定溶液中物質(zhì)濃度的電化學(xué)分析方法,具有設(shè)備簡(jiǎn)單、分析速度快、準(zhǔn)確度高、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),但是有設(shè)備昂貴、不易保養(yǎng)以及重現(xiàn)性差等缺陷[12-13]。離子色譜法是利用陰陽(yáng)離子對(duì)載體(樹(shù)脂)的吸附能力不同達(dá)到分離的目的[14-16]?？偟膩?lái)說(shuō),色譜法具有線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便特點(diǎn),但有設(shè)備儀器昂貴、操作人員要求高、耗時(shí)等缺點(diǎn);此外,亞硝酸鹽的檢測(cè)方法還有毛細(xì)管電泳法、催化光度法、熒光光度法、流動(dòng)注射分光光度法、電化學(xué)伏安法、氣相色譜法以及高效液相色譜法等。光度法使用方便但是不夠靈敏,容易受干擾,其他方法雖有達(dá)到較低檢測(cè)限,但是設(shè)備昂貴,不易保養(yǎng),操作繁雜,不宜大批檢測(cè)樣品,又或者耗時(shí)長(zhǎng),時(shí)效性不高。因此改進(jìn)光度法,使其克服固有的缺點(diǎn)是一個(gè)建立新方法的思路。

在本研究中,將對(duì)氨基苯硫酚(ATP)和萘基乙二胺(NED)分別修飾在納米金顆粒上之后,在酸性條件下,再加入亞硝酸鹽,體系將會(huì)發(fā)生重氮化耦合反應(yīng),使金納米顆粒發(fā)生聚集,從而導(dǎo)致體系光學(xué)性質(zhì)(顏色)發(fā)生變化。通過(guò)探究顏色變化與亞硝酸鹽濃度的關(guān)系來(lái)建立亞硝酸鹽檢測(cè)方法,計(jì)算檢測(cè)限。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包 包頭市味多美食品有限公司;火腿 河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司;海帶絲 山東煙臺(tái)萬(wàn)歷海藻食品有限公司;袋裝牛奶 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司;瓶裝水 康師傅控股有限公司;實(shí)驗(yàn)所用食品材料 為市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)所得;水合氯金酸(HAuCl4) Sigma Aldrich公司;檸檬酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、對(duì)氨基苯硫酚ATP、鹽酸萘乙二胺NED、巰基乙酸 北京化學(xué)試劑公司;亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL) 成都博瑞特化學(xué)技術(shù)有限公司,可直接使用無(wú)需校準(zhǔn);濃鹽酸、氫氧化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠;無(wú)水乙醇、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅 麥克林試劑有限公司;去離子水 天津卓精虹科儀器設(shè)備技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

U-2900型紫外分光光度計(jì) Hitachi;ZS90型粒度電位儀 Malvern;瓊脂糖電泳設(shè)備 天津市華茂電泳設(shè)備有限公司;磁力攪拌器及其配套電熱套 鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司;小型振蕩器 上海亞榮生化儀器廠;離心機(jī) 上海盧湘儀;JR05-300型食品粉碎機(jī) 浙江蘇泊爾股份有限公司;KQ-100DE型超聲波儀(輸出功率:400 W)昆山市超聲儀器有限公司以及其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)室器皿。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理方法 取面包、火腿、海帶絲各0.25 g分別放入食品粉碎機(jī)再加入10 mL水,粉碎25 min,并轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中,三次用少量水(2 mL左右)清洗粉碎機(jī)杯壁倒入容量瓶中,再定容到25 mL;瓶裝水和袋裝牛奶直接轉(zhuǎn)移到容量瓶并定容到25 mL[17-19]。所有樣品定容后,在超聲清洗機(jī)中(400 W)浸泡30 min,然后2000 r/min離心15 min,取上清液5 mL(其中瓶裝水樣品無(wú)分層),加入200 μL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L),再加入0.5 mL乙酸鋅溶液(220 g/L),手動(dòng)攪拌5～10 min,過(guò)濾得到樣品液[20];用體系檢測(cè)樣品液亞硝酸鹽濃度c(μg/mL),即樣品的亞硝酸鹽含量:C=c×25/0.25(μg/g),C=100c。

1.2.2 傳統(tǒng)比色法檢測(cè)亞硝酸鹽

1.2.2.1 傳統(tǒng)比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考國(guó)標(biāo)GB 5009.33-2016,1000 μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液用去離子水分別稀釋到0.05、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL,再分別取4.7 mL稀釋液和去離子水(空白),分別放在試管中,加入0.2 mL 4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液,混勻,靜置3～5 min后各加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液,混勻靜置10 min。用1 cm比色杯,以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn),于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]。

1.2.2.3 傳統(tǒng)比色法的加標(biāo)回收試驗(yàn) 以正常銷售的鮮牛奶和瓶裝水為空白,分別取鮮牛奶和瓶裝水2.5 g。向兩種樣品中分別加入1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品,用去離子水定容25 mL,在輸出功率400 W的超聲儀中浸泡30 min;離心取上清液5 mL,加入200 μL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L),再加入0.5 mL乙酸鋅溶液(220 g/L),攪拌5～10 min,過(guò)濾得到樣品液,然后用傳統(tǒng)比色法檢測(cè)樣品液的亞硝酸鹽濃度c,即亞硝酸鹽的添加量m=c×25,計(jì)算出回收率并重復(fù)10次計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.3 改良比色法檢測(cè)亞硝酸鹽

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)原理 利用金納米顆粒優(yōu)秀的光學(xué)性質(zhì),將對(duì)氨基苯硫酚通過(guò)S-Au鍵修飾到水相金納米顆粒記為ATP-GNPs;將萘基乙二胺(NED)通過(guò)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)催化,連接到雙親性聚合物包裹的油相金納米顆粒(AP-GNPs)上得到萘基乙二胺修飾的金納米顆粒記為NA-GNPs,在酸性條件下,加入NO2-后,發(fā)生重氮化耦合反應(yīng),兩種修飾過(guò)的金納米顆粒被連在一起,發(fā)生聚合,金納米顆粒的顏色發(fā)生明顯變化,這種變化與NO2-的濃度呈良好線性關(guān)系?？傊?改進(jìn)比色法用金納米顆粒的靈敏的光學(xué)變化代替了耦合反應(yīng)生成的染料分子的顏色變化,使體系的檢測(cè)線更低,靈敏度更高,如圖1。

圖1 改良比色法基本原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the the improved colorimetric basic principle

1.2.3.2 ATP-GNP的制備及表征 取17 mg水合氯金酸溶于50 mL的去離子水中,沸騰回流10 min,溶液呈淡黃色;78 mg檸檬酸鈉溶于5 mL去離子水中,預(yù)熱到60～70 ℃,快速加入到回流后的水合氯金酸的溶液中,繼續(xù)加熱回流20 min,溶液顏色由黃色變無(wú)色隨后顏色逐漸加深，最后呈透亮的深紅色,冷卻至室溫,調(diào)節(jié)pH到7,用0.45 μm的濾膜過(guò)濾兩次,室溫備用,這時(shí)的金納米顆粒GNPs的粒徑大約為10 nm[22]。由郎伯比爾定律(式1)計(jì)算得到的GNPs的吸光度為A=1.924,可計(jì)算得知GNPs的濃度c=1.40×10-8mol/L。

郎伯比爾定律A=ε×C×l

式(1)

式中:A是吸光度值,ε是吸收常數(shù),l是光徑長(zhǎng)度(cm,所使用的儀器光徑長(zhǎng)度規(guī)格為1 cm),ε10 nm=1.37×108cm-1mol-1L。

將制備好的金納米顆粒稀釋10倍,將pH調(diào)整到弱酸性(pH=3～4),用10 mmol/L的ATP(溶解于無(wú)水乙醇)與稀釋后的納米金顆粒按體積1∶8的比例混合均勻,在搖床上勻速振蕩6 h,反應(yīng)后,用5000 r/min離心30 min,去上清,再用去離子水溶解,反復(fù)3～5次,即得到ATP-GNPs。ATP-GNPs的粒徑約為10 nm,由郎伯比爾定律[23-24],計(jì)算出ATP-GNPs濃度約為10-9mol/L。

制備ATP-GNPs之后,在室溫下利用粒徑電位儀、全波譜紫外分光光度計(jì)表征GNPs和ATP-GNPs的粒徑分布、電位變化以及吸收?qǐng)D譜的變化,其中樣品皿的規(guī)格為:1×1 cm的石英皿。

1.2.3.3 NA-GNPs的制備及表征 有機(jī)相金納米顆粒是在有機(jī)相中用硼氫化鈉快速還原氯金酸得到的,再利用兩親性的聚合物的包裹使其“溶解”到水相中,再通過(guò)反應(yīng)將萘基乙二胺連接到兩親性聚合物的羧基上,最終得到萘基乙二胺修飾的金納米顆粒(NA-GNPs),詳細(xì)反應(yīng)步驟見(jiàn)a～d。

a:有機(jī)相合成金納米顆粒GNPs:取2.17 g四辛基溴化銨溶于80 mL甲苯中,在輸出功率400 W的超聲儀中浸泡2～3 min使四辛基溴化銨完全溶解,溶液澄清透明無(wú)雜質(zhì)[25]。取300 mg氯金酸溶于25 mL純水中,溶液為澄清的黃色。上述兩種溶液混合,輕搖直到水相中的黃色完全消失,有機(jī)相變成紅色。用分液漏斗將水油分開(kāi),有機(jī)相轉(zhuǎn)移到燒瓶中。334 mg硼氫化鈉溶于25 mL純水。硼氫化鈉溶液在1 min之內(nèi)加入之前含有金的甲苯溶液中,邊攬拌邊滴加。然后金溶液在室溫下攪拌l h。攪拌l h之后,再利用分液漏斗溶液將水油分開(kāi),有機(jī)相先用10 mmol/L鹽酸洗3遍,再用10 mmol/L氫氧化鈉洗3遍。將溶液轉(zhuǎn)到燒瓶中攪拌12 h后加入10 mL十二硫醇,65 ℃水浴攪拌3 h。所得溶液2000 r/min離心5 min,收集上清,去除雜質(zhì)。再按1∶1加入甲醇2000 r/min離心5 min。去除含有四辛基溴化銨和十二硫醇的上清液,收集GNPs沉淀溶于氯仿中。合成的GNPs粒徑約5 nm。

b:制備兩親性聚合物:2.7 g十二胺和3.084 g聚(異丁烯-alt-馬來(lái)酸酐)溶于100 mL四氫呋喃,55～60 ℃水浴攪拌l h。此過(guò)程四氫呋喃會(huì)揮發(fā),溶液大概濃縮到30～40 mL。停止加熱,剩余溶液在室溫下攪拌12 h。利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使四氫呋喃完全揮發(fā),加入40 mL氯仿劇烈攪拌,使瓶底附著的物質(zhì)完全溶解,最終所得兩親性聚合物AP。

c:AP包被GNPs:取1 mL GNPs(溶于氯仿)于圓底燒瓶,再加入0.2 mL AP,搖晃均勻,加入5 mL的氯仿降低體系濃度。緩慢抽真空使氯仿?lián)]發(fā)直到混合物完全干燥。加入適量SB12(0.05 mol/L硼酸緩沖液,pH=12)劇烈攪拌,使粘附在瓶壁上的物質(zhì)完全溶解。用60000 r/min離心30 min進(jìn)行純化,去上清用去離子水復(fù)溶,重復(fù)3～5次,就得到兩親性聚合物包被的金納米顆粒,記為AP-GNPs,如圖2。

圖2 AP包被GNPs的示意圖Fig.2 Scheme of AP coating on GNPs

d:萘基乙二胺修飾AP-GNPs得到NA-GNPs：10 mL 20 mmol/L鹽酸萘乙二胺溶液(溶于硼酸緩沖液,pH調(diào)到9)與1 mL AP-GNPs混勻,再加入1 mL 0.5 mol/L的EDC,混勻靜置3 h。用60000 r/min離心30 min進(jìn)行純化,去上清用去離子水復(fù)溶,重復(fù)3～5次,就得到NA-GNPs,其粒徑約為10 nm。由郎伯比爾定律,計(jì)算出NA-GNPs濃度約為210-7mol/L。將NA-GNPs稀釋20倍后,與ATP-GNPs等體積混合,將體系pH調(diào)整到5,作為反應(yīng)液存放于-4 ℃?zhèn)溆谩喯跛徕c標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋到0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5 μg/mL。分別取濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液和去離子水(空白)0.5 mL,再加入0.5 mL反應(yīng)液,混勻靜置15～20 min,測(cè)體系的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

e:表征:在室溫下利用粒徑電位儀、全波譜紫外分光光度計(jì)表征油相GNPs、AP-GNPs和NA-GNP的粒徑分布、電位變化以及吸收?qǐng)D譜的變化,其中樣品皿的規(guī)格為:1×1 cm的石英皿。

1.2.4 存放時(shí)間和其他離子對(duì)檢測(cè)體系的影響 將反應(yīng)液存放1、2、3、4、5周,分別測(cè)紫外吸光度,觀察金納米顆粒520 nm處的特征吸收峰,證明反應(yīng)液的穩(wěn)定性。

1.2.5 改良比色法的加標(biāo)回收試驗(yàn) 以正常市售的鮮牛奶和瓶裝水為空白,分別取鮮牛奶和瓶裝水2.5 g。向兩種樣品中分別加入5、10、20 μg的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品,定容25 mL,攪拌超聲浸泡30 min;以2000 r/min離心15 min取上清液5 mL,加入200 μL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L),再加入0.5 mL乙酸鋅溶液(220 g/L),攪拌5～10 min,過(guò)濾得到樣品液,然后用改良比色法檢測(cè)樣品液的亞硝酸鹽濃度c,即亞硝酸鹽的添加量m=c×25,計(jì)算出回收率并重復(fù)10次計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[26-27]。

1.2.6 兩種比色法的實(shí)際應(yīng)用 將面包、火腿、海帶絲打開(kāi)包裝,放置在常溫(25 ℃)下0、5、10、15、20、25、30、35、40 h,分別取0.25 g各個(gè)時(shí)段的面包、火腿、海帶絲,按照1.2.1制備樣品液,C樣品=100c樣品液(μg/g)。用傳統(tǒng)比色法和改良比色法檢測(cè)樣品液,對(duì)比兩種比色法的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)比色法檢測(cè)亞硝酸鹽

圖3 傳統(tǒng)比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和各樣品的顏色變化Fig.3 Standard curve of traditional colorimetric method and the color changes of the samples

圖4 不同離子對(duì)體系的影響Fig.4 Effect of different ions on the reaction solution

2.1.3 傳統(tǒng)比色法的加標(biāo)回收試驗(yàn) 按照1.2.2.3的方法,傳統(tǒng)比色法的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果如表1。由表1可見(jiàn),在加入1.00 μg/mL時(shí),傳統(tǒng)比色法無(wú)法檢測(cè)出準(zhǔn)確的亞硝酸鹽含量,顯然加標(biāo)樣品的亞硝酸鹽含量已經(jīng)低于其檢測(cè)限,因此傳統(tǒng)比色法在應(yīng)用方面有檢測(cè)限的局限。在5.00、10.00、20.00 μg/mL的加標(biāo)樣品的回收率為97.88%～100.24%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.53%～7.22%。

表1 傳統(tǒng)比色法的回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recovery rate and relative deviation(RSD)of the traditional colorimetric method(n=10)

2.2 ATP-GNPs的表征

通過(guò)1.2.3.2的方法制備出水相金納米顆粒(GNPs),對(duì)氨基苯硫酚(ATP)修飾到金納米顆粒之后,由于金納米顆粒表面配體的變化,紫外吸收峰有少許偏移,純化過(guò)程有少量損失,所以吸收峰強(qiáng)度下降,如圖5;表面電位也有變化,如圖6;ATP-GNPs的粒徑約是10 nm,如圖7。

圖5 ATP修飾GNPs前后紫外吸收?qǐng)D譜的變化Fig.5 Changes in UV absorption spectra before and after ATP-modified GNPs

圖6 ATP修飾GNPs前后表面電位的變化Fig.6 Changes in surface potential before and after ATP-modified GNPs

圖7 ATP-GNPs的粒徑表征Fig.7 Particle size characterization of ATP-GNPs

2.3 油相GNPs、AP-GNPs、NA-GNPs的表征

用1.2.3.3方法步驟制作出油相GNPs的粒徑約為5 nm,用AP包被后的AP-GNPs的粒徑約為10 nm,而且紫外吸收吸收峰發(fā)生偏移;由于疏水性,油相GNPs被AP包被,親水的羧基暴露在外側(cè),在EDC的催化下與萘基乙二胺(NED)的氨基連接在一起。純化后把多余的NED去除,就得到了NA-GNPs,由于NED的分子較小,因此NA-GNPs的紫外吸收峰相對(duì)于AP-GNPs幾乎沒(méi)有變化,粒徑的變化也不大,只有純化過(guò)程中有損失,峰強(qiáng)度降低。油相GNPs、AP-GNPs、NA-GNPs的紫外吸收?qǐng)D譜、粒徑,如圖8、圖9。

圖8 油相GNPs、AP-GNPs、NA-GNPs的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.8 Ultraviolet absorption spectra of oil phase GNPs,AP-GNPs and NA-GNPs

圖9 油相GNPs、AP-GNPs、NA-GNPs的粒徑表征Fig.9 Size characterization of oil phase GNPs,AP-GNPs and NA-GNPs

2.4 改良比色法的結(jié)果分析

圖10 加入濃度梯度溶液后體系的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.10 UV absorption spectrum of the system by adding a concentration gradient solution

圖11 濃度梯度的的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11 Standard curve of concentration gradient

圖12 同等條件下,加入溶液前(右)和后(左),金納米顆粒的聚集情況Fig.12 Aggregation of gold nanoparticles before(right)and after(left)addition of solution under equivalent conditions

利用空白樣品液10次測(cè)量吸光度得到10個(gè)A580 nm/A520 nm的值,其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.11%。由公式dl=3σ/k,其中dl是檢測(cè)限,σ是指空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k是指標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。通過(guò)計(jì)算體系的檢測(cè)限dl=5.12 ng/mL。

2.5 存放時(shí)間和其他離子對(duì)檢測(cè)體系的影響

圖13 不同存放時(shí)間,反應(yīng)液的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.13 UV absorption spectrum of the reaction solution at different storage time

圖14 不同離子對(duì)反應(yīng)液的影響Fig.14 Effect of different ions on the reaction solution

2.6 改良比色法的加標(biāo)回收試驗(yàn)

按照1.2.5的方法,改良比色法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

由表2可見(jiàn),樣品回收率為97.00%～100.28%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.77%～3.88%,表明本實(shí)驗(yàn)方法具有可靠地準(zhǔn)確度和精密度。

表2 改良比色法的回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Spike recovery rate and relative deviation(RSD)of the improved colorimetric method(n=10)

2.7 改良比色法與傳統(tǒng)比色法的比較

2.7.1 檢測(cè)范圍和檢出限的比較 兩種方法的檢測(cè)范圍差異很大,表明了改良比色法檢測(cè)極微量的亞硝酸鹽方面的優(yōu)勢(shì),但是傳統(tǒng)比色法檢測(cè)范圍更廣。改良比色法的檢測(cè)限低至5.12 ng/mL,比傳統(tǒng)比色法靈敏度更高。在2.6中也能得到證實(shí),加標(biāo)1.00 μg的樣品處理液的濃度為40 ng/mL,傳統(tǒng)比色法無(wú)檢測(cè)信號(hào),然而改良比色法能夠正常的檢測(cè)其濃度,因此顯示出改良比色法的優(yōu)勢(shì)。

2.7.2 回收率的比較 改良比色法和傳統(tǒng)比色法各自的檢測(cè)范圍內(nèi)的回收率相差無(wú)幾,約為97%～100%,說(shuō)明兩種方法在各自的檢測(cè)范圍內(nèi)都有良好的準(zhǔn)確性和可靠性;傳統(tǒng)比色法的RSD為3.53%～7.22%，明顯比改良比色法大,說(shuō)明改良比色法檢測(cè)結(jié)果的離散度程度較小,即檢測(cè)穩(wěn)定性比傳統(tǒng)比色法優(yōu)秀。

2.7.3 響應(yīng)時(shí)間的比較 傳統(tǒng)比色法是先用對(duì)氨基苯磺酸與亞硝酸根發(fā)生重氮化反應(yīng)(3～5 min),再與萘基乙二胺鹽酸鹽發(fā)生耦合顯色(15 min),整個(gè)過(guò)程需要15～20 min,而改良比色法的對(duì)氨基苯硫酚和萘基乙二胺連接到金納米顆粒后,使用時(shí)只加入亞硝酸鈉溶液即可,這一過(guò)程約15 min,所以改良比色法操作簡(jiǎn)單,節(jié)約反應(yīng)時(shí)間,提高效率。

表3 改良比色法與傳統(tǒng)比色法的比較Table 3 Comparison between improved colorimetry and traditional colorimetry

2.7.4 穩(wěn)定性的比較 改良比色法的兩種金納米顆粒混合后可以穩(wěn)定存放5周以上,Cu2+、Fe2+、Fe3+對(duì)新舊兩種檢測(cè)體系都有少許影響,可能是因?yàn)檩^高濃度的干擾離子本身的顏色對(duì)檢測(cè)體系的吸光度有一些影響;總之改良比色法具有良好的穩(wěn)定性和抗離子干擾的能力。

2.7.5 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD的比較 傳統(tǒng)比色法的RSD為3.53～7.22，明顯比改良比色法大,說(shuō)明改良比色法檢測(cè)結(jié)果的離散度程度較小,即檢測(cè)穩(wěn)定性比傳統(tǒng)比色法優(yōu)良。

總的來(lái)說(shuō),與傳統(tǒng)比色法相比,改良比色法具有檢測(cè)限低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì),但是檢測(cè)范圍窄是改良比色法的缺點(diǎn)。改良比色法適用于極微量的亞硝酸鹽的檢測(cè),如飲用水、牛奶、嬰兒食品等亞硝酸鹽含量允許添加量極低的食品的檢測(cè),或者研究食品中亞硝酸鹽的產(chǎn)生過(guò)程。

2.8 兩種比色法的實(shí)際應(yīng)用

查閱中國(guó)的食品標(biāo)準(zhǔn),面包的允許殘留量為2 g/mg,火腿的允許殘留量為70 μg/mg,海帶絲的允許殘留量為20 μg/mg。如圖15,面包的亞硝酸鹽含量較低,傳統(tǒng)比色法檢測(cè)時(shí),30 h之前無(wú)法響應(yīng),只有亞硝酸鹽增加到傳統(tǒng)比色法的檢測(cè)限后,才能有響應(yīng)。然而改良比色法檢測(cè)樣品時(shí),能夠很好地反應(yīng)亞硝酸鹽的增長(zhǎng)過(guò)程;火腿的亞硝酸鹽含量較高,如圖16,20 h后,樣品的亞硝酸鹽含量就達(dá)到了新方法的檢測(cè)極限,于是體系處于飽和狀態(tài),無(wú)法準(zhǔn)確記錄后面的樣品?；鹜戎衼喯跛猁}含量較高,而且暴露15 h后,亞硝酸鹽增速加大,25 h左右就超過(guò)了允許殘留量,如圖17。海帶絲在工廠腌制過(guò)程中,一般都存放超過(guò)20 d,產(chǎn)品中有一定的乳酸菌消耗了亞硝酸鹽,因此樣品的亞硝酸鹽含量增速較慢,但是也不宜存放超過(guò)30 h。總之,改良比色法優(yōu)化了檢測(cè)限,但是檢測(cè)范圍較窄(0～1 μg/mL),因此改良比色法適用于極低含量亞硝酸鹽的測(cè)定,如奶制品、面制品等;另一方面,改良比色法可以用于環(huán)境污染監(jiān)測(cè),如水庫(kù)、江河水的亞硝酸鹽含量的檢測(cè)等。

圖15 面包中的亞硝酸鹽的含量變化Fig.15 Changes in nitrite content in bread

圖16 火腿中的亞硝酸鹽的含量變化Fig.16 Changes in nitrite content in ham

圖17 海帶絲中的亞硝酸鹽的含量變化Fig.17 Changes in nitrite content in seaweed strips

3 結(jié)論

在本研究中,利用功能化金納米顆粒對(duì)傳統(tǒng)比色法進(jìn)行了改良。相比傳統(tǒng)比色法,改良比色法的檢測(cè)限達(dá)到了5.12 ng/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)比色法(76.43 ng/mL)。改良比色法的操作步驟簡(jiǎn)便、響應(yīng)時(shí)間短,大大提高了工作效率。雖然Cu2+、Fe2+、Fe3+對(duì)傳統(tǒng)比色法和改良比色法都有影響,但是改良比色法在回收率、RSD方面有很大優(yōu)勢(shì),說(shuō)明此方法的穩(wěn)定性更高，更能適應(yīng)更復(fù)雜的工作環(huán)境。改良比色法的檢測(cè)范圍較窄,更加適用于微量亞硝酸鹽含量的檢測(cè),是傳統(tǒng)比色法的有效補(bǔ)充和改進(jìn)。在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),食品打開(kāi)包裝后,應(yīng)盡快用完,否則有亞硝酸鹽超標(biāo)的危險(xiǎn)。改良比色法具有高靈敏性的特點(diǎn),有利于研究亞硝酸鹽產(chǎn)生的過(guò)程和原因,以及預(yù)防亞硝酸鹽的產(chǎn)生。

權(quán)威·高效·核心·領(lǐng)先·精湛·實(shí)用