?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料研制及其體外抗氧化活性

(鄭州工商學(xué)院,河南鄭州 451400)

人體在運(yùn)動(dòng)時(shí),易產(chǎn)生疲勞狀態(tài),使得機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡被破壞,生成的過(guò)量自由基容易造成組織損傷,進(jìn)而引發(fā)一系列疾病。運(yùn)動(dòng)飲料因具有較好的抗氧化作用,可為疲勞機(jī)體快速補(bǔ)充水分、電解質(zhì)與能量,因此被大量研究[1-2]。?；撬嶙鳛榉堑鞍踪|(zhì)氨基酸,具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、提高機(jī)體生理功能與免疫的能力,特別是其在增強(qiáng)心肌收縮力,維持機(jī)體運(yùn)動(dòng)的同時(shí),還可防止心肌受損、保護(hù)肝臟,因而在運(yùn)動(dòng)飲料成分中充當(dāng)“主要角色”,并在食品添加劑中大量應(yīng)用[3-4]。然而?；撬岬氖褂贸杀局鹉赀f增,如何在減少運(yùn)動(dòng)飲料中?；撬嵊昧康耐瑫r(shí)，維持相同的抗氧化作用效果的相關(guān)研究具有重大意義。

薄荷,唇形科薄荷屬草本植物,富含黃酮與迷迭香酸類化合物[5],She等[6]研究發(fā)現(xiàn),水溶液分離出的酚酸類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,可以快速消除運(yùn)動(dòng)疲勞或損傷生成的氧自由基,抑制羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)與功能。本研究以牛磺酸與薄荷為原料,利用薄荷的藥食兩用特性與功效,減少?；撬嵩谶\(yùn)動(dòng)飲料的常規(guī)濃度,同時(shí)輔以白砂糖、黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結(jié)冷膠,研制?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料,通過(guò)檢測(cè)其對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基與DPPH自由基的清除率,觀察其抗氧化作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

?；撬?潛江永安藥業(yè)股份有限公司;新鮮薄荷葉、白砂糖 某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);羧甲基纖維素鈉 武漢艾諾森生物科技有限公司;黃原膠 濟(jì)南意和旺化工科技有限公司;結(jié)冷膠 湖南億全生物科技有限公司;硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、雙氧水、磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水楊酸、甲硫氨酸、核黃素 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氮鹽四唑(NBT)、DPPH自由基 美國(guó)Sigma公司;HN功能飲料 市售;試驗(yàn)用水 超純水。

TP-A200電子天平 長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司;UV-7504紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司;高壓均質(zhì)機(jī) 上海諾尼輕工機(jī)械有限公司;BW4T150Q灌裝機(jī) 浙江博煒食品機(jī)械有限公司;FZG-20干熱滅菌柜 南京煜鑫機(jī)械科技有限公司;KQ500DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;H1-16K離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 復(fù)合飲料工藝流程圖[7]如圖1所示。

圖1 復(fù)合飲料工藝流程圖Fig.1 The technological process of mixed sports beverage

1.2.2 工藝要點(diǎn)

1.2.2.1 薄荷液制備 定量稱取薄荷葉,洗凈后粉碎,加入一定體積的純化水,在溫度50 ℃,功率400 W條件下超聲提取30 min后,以4000 r/min速率離心10 min,即得薄荷液[8]。

1.2.2.2 調(diào)配 薄荷液、牛磺酸、白砂糖以一定比例在水中混合成原料液后,加入復(fù)合穩(wěn)定劑(黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結(jié)冷膠按一定配比制得的溶液),調(diào)配至成品。

1.2.2.3 均質(zhì)、灌裝與滅菌 成品料液均質(zhì)攪拌2次后灌裝,于121 ℃滅菌10 min,冷卻后制得運(yùn)動(dòng)飲料[9]。

1.2.3 復(fù)合飲料配方優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在薄荷液8%、白砂糖4%條件下,考察?；撬嵊昧?0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響;在牛磺酸0.03%、白砂糖4%條件下,考察薄荷液用量(2%、4%、6%、8%、10%)對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響;在牛磺酸0.03%、薄荷液8%條件下,考察白砂糖用量(2%、3%、4%、5%、6%)對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響。在上述單因素實(shí)驗(yàn)中,固定復(fù)合穩(wěn)定劑添加量為黃原膠0.15%、羧甲基纖維素鈉0.30%、結(jié)冷膠0.08%。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以?；撬?A)、薄荷液(B)、白砂糖(C)用量為考察因素,進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn),具體因素水平見(jiàn)表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3.3 感官評(píng)價(jià) 參考口服飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10],制定?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),見(jiàn)表2所示,聘請(qǐng)具有飲料感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的10位食品工作者,分別按照色澤、氣味、口感與組織形態(tài)四個(gè)維度,對(duì)不同配方參數(shù)制得的運(yùn)動(dòng)飲料進(jìn)行評(píng)價(jià),每個(gè)樣品重復(fù)3次,取平均值。

表2 ?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of taurine and mint mixed sports beverage

2.4 復(fù)合穩(wěn)定劑配比設(shè)計(jì)

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在羧甲基纖維素鈉0.30%、結(jié)冷膠0.08%條件下,考察黃原膠用量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)對(duì)離心沉淀率的影響;在黃原膠0.15%、結(jié)冷膠0.08%條件下,考察羧甲基纖維素鈉用量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對(duì)離心沉淀率的影響;在黃原膠0.15%、羧甲基纖維素鈉0.30%條件下,考察結(jié)冷膠用量(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)對(duì)離心沉淀率的影響。在上述單因素實(shí)驗(yàn)中,固定原料液配比為牛磺酸0.03%、薄荷液8%、白砂糖4%。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以黃原膠(A)、羧甲基纖維素鈉(B)、結(jié)冷膠(C)用量為響應(yīng)因素,離心沉淀率為響應(yīng)值(Y),設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),利用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,優(yōu)化復(fù)合穩(wěn)定劑配比,試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels in response surface experiment

1.2.4.3 離心沉淀率測(cè)定 以離心沉淀率衡量運(yùn)動(dòng)飲料的穩(wěn)定性,離心沉淀率越大,則溶液穩(wěn)定性越差。稱取復(fù)合飲料m0,置于離心管中,以3000 r/min,離心10 min后,對(duì)管內(nèi)上清液稱重，記為m,按照下式計(jì)算溶液的離心沉淀率,平行測(cè)定三次[11]。

式(1)

式中:w為溶液離心沉淀率,%;m0為復(fù)合飲料初始質(zhì)量,g;m為離心后上清液質(zhì)量,g。

1.2.5 貯藏穩(wěn)定性研究 灌裝滅菌后的產(chǎn)品分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱和4 ℃冰箱存放6個(gè)月,觀察有無(wú)明顯沉淀與分層。

1.2.6 自由基清除率測(cè)定

1.2.6.1 羥自由基清除率 準(zhǔn)確移取2 mL復(fù)合飲料于試管內(nèi),另加入2 mL硫酸亞鐵(9 mmol/L)和2 mL水楊酸(9 mmol/L)搖勻,隨后加入2 mL雙氧水(20 mmol/L)混合搖勻后,于37 ℃水浴加熱30 min,以純化水作空白對(duì)照,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,平行測(cè)定六次,按照下式計(jì)算清除率[12]。

式(2)

式中,A1為樣品測(cè)定吸光度值;A2為以水替代雙氧水溶液時(shí)樣品的吸光度值;A0為以水替代樣品時(shí)空白對(duì)照的吸光度值;w為羥自由基清除率,%。

1.2.6.2 超氧陰離子自由基清除率 準(zhǔn)確移取1 mL復(fù)合飲料于試管內(nèi),依次加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液,1.5 mL 甲硫氨酸(0.026 mol/L),0.5 mL NBT(0.08 mol/L)和0.3 mL核黃素(0.02 mol/L),搖勻后,光照30 min,以純化水作空白對(duì)照,于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,平行測(cè)定六次,按照公式2計(jì)算清除率[13]。

1.2.6.3 DPPH自由基清除率 準(zhǔn)確移取2 mL復(fù)合飲料于試管內(nèi),加入2 mL DPPH自由基乙醇溶液(0.2 mol/L),搖勻后,避光30 min,以無(wú)水乙醇作空白對(duì)照,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,平行測(cè)定六次,按照下式計(jì)算清除率[14]。

式(3)

式中,A1為樣品測(cè)定吸光度值;A2為以水替代DPPH乙醇溶液時(shí)樣品的吸光度值;A0為以水替代樣品時(shí)空白對(duì)照的吸光度值;w為DPPH自由基清除率,%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

復(fù)合飲料抗氧化性檢測(cè)結(jié)果采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述,利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,當(dāng)P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料原料液配比優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 ?；撬嵊昧坑绊?不同?；撬嵊昧繉?duì)運(yùn)動(dòng)飲料的感官評(píng)價(jià)影響見(jiàn)圖2所示。從圖2可知,當(dāng)?；撬嵊昧吭?.03%時(shí),感官評(píng)價(jià)得分最高為(83.7±0.9)分,此時(shí)溶液呈淡黃色,酸甜適中,而濃度較高時(shí),溶液顏色加深,混濁感較明顯,因此本研究選擇牛磺酸用量0.02%、0.03%、0.04%作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖2 ?；撬嵊昧繉?duì)復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料感官影響Fig.2 Effect of taurine addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.1.2 薄荷液用量影響 不同薄荷液用量對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料的感官評(píng)價(jià)影響見(jiàn)圖3所示。從圖3可知,隨著薄荷液用量增多,復(fù)合飲料感官評(píng)價(jià)結(jié)果先升高后降低,在8%時(shí)達(dá)到最高為(84.1±1.7)分。薄荷液濃度偏高時(shí),溶液的清涼口感較重,掩蓋了其它成份味道,因此本研究選擇薄荷液用量7%、8%、9%作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖3 薄荷液用量對(duì)復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料感官影響Fig.3 Effect of mint liquid addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.1.3 白砂糖用量影響 運(yùn)動(dòng)飲料中添加白砂糖有利于調(diào)整口感,不同白砂糖用量對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料的感官評(píng)價(jià)影響見(jiàn)圖4所示。從圖4可知,白砂糖用量4%時(shí),感官評(píng)價(jià)得分最高為(84.3±0.8)分。當(dāng)用量較低時(shí),溶液甜味偏低,澀味較重,而用量較高時(shí),飲料甜度偏大,影響自身風(fēng)味[15-16],因此本研究選擇白砂糖用量3%、4%、5%作為正交試驗(yàn)考察水平。

圖4 白砂糖用量對(duì)復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料感官影響Fig.4 Effect of white sugar addition on sensory score of mixed sports beverage

2.1.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,?；撬?、薄荷液與白砂糖用量對(duì)飲料的感官評(píng)價(jià)影響較大,但考慮單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果并非最優(yōu)值,因此設(shè)計(jì)以三者為變量的三因素三水平正交試驗(yàn),確定飲料原料液的最佳配比,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4所示。

從表4可知,RC>RB>RA,各因素對(duì)牛磺酸薄荷復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料的感官評(píng)價(jià)影響順序?yàn)?白砂糖用量>薄荷液用量>牛磺酸用量,通過(guò)極差分析可知,飲料原料液最佳配比為A2B1C1,即?；撬嵊昧?.03%,薄荷液用量6%,白砂糖用量3%。在該配比下,運(yùn)動(dòng)飲料的感官評(píng)分為(87.3±0.9)分,此時(shí)溶液的薄荷氣味濃郁,色澤均勻、透亮,呈淺黃色,酸甜適中,具有清涼感,無(wú)明顯沉淀與分層。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal test

2.2 復(fù)合穩(wěn)定劑配比

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 黃原膠用量影響 薄荷葉在超聲分離提取后,仍有部分纖維組織或大分子物質(zhì)進(jìn)入上清液,因此利用復(fù)合穩(wěn)定劑提高溶液的穩(wěn)定性。圖5為黃原膠用量對(duì)溶液離心沉淀率的影響,從圖5可知,隨著黃原膠用量的增多,離心沉淀率不斷減小,至0.15%后基本未變。這是因?yàn)辄S原膠可吸附帶正電荷的蛋白質(zhì)大分子,形成空間位阻,從而減少蛋白質(zhì)沉淀[17],因此本研究選擇黃原膠用量0.10%、0.15%、0.20%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖5 黃原膠用量對(duì)離心沉淀率的影響Fig.5 Effect of xanthan gum content on centrifugation sedimentation rate

2.2.1.2 羧甲基纖維素鈉用量影響 羧甲基纖維素鈉與黃原膠復(fù)配具有較好協(xié)同增效效果,聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可顯著增加飲料的穩(wěn)定性[18]。從圖6可見(jiàn),當(dāng)用量為0.3%時(shí),溶液沉淀離心率下降趨于穩(wěn)定,因此本研究選擇羧甲基纖維素鈉用量0.2%、0.3%、0.4%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖6 羧甲基纖維素鈉用量對(duì)離心沉淀率的影響Fig.6 Effect of carboxymethyl cellulose sodium content on centrifugation sedimentation rate

2.2.1.3 結(jié)冷膠用量影響 結(jié)冷膠可有效提高運(yùn)動(dòng)飲料的穩(wěn)定性與懸浮能力[19-20],由圖7可知,隨著結(jié)冷膠用量增多,離心沉淀率逐漸下降,當(dāng)用量增加至0.08%后,基本穩(wěn)定,因此本研究選擇結(jié)冷膠用量0.07%、0.08%、0.09%作為響應(yīng)面因素考察水平。

圖7 結(jié)冷膠用量對(duì)離心沉淀率的影響Fig.7 Effect of gellan gum content on centrifugation sedimentation rate

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以黃原膠、羧甲基纖維素鈉及結(jié)冷膠用量為響應(yīng)面考察因素,進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the response surface experiment

上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到以離心沉淀率為目標(biāo)函數(shù),各參數(shù)編碼值的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=1.14+0.024A-0.053B-0.061C+0.025AB+0.048AC+0.075BC+0.11A2-1.25×10-3B2+0.12C2,對(duì)該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表6所示。

從表6可知,該回歸模型P<0. 01,表明該模型極顯著,可較好反映實(shí)際結(jié)果,R2=0.9409顯示該模型擬合值與實(shí)際結(jié)果具有高度相關(guān)性,而模型失擬項(xiàng)P=0.3383>0.05表示沒(méi)有顯著性差異。一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)BC對(duì)離心沉淀率的影響顯著(P<0.05);一次項(xiàng)C,二次項(xiàng)A2、C2對(duì)離心沉淀率的影響極顯著(P<0.01)。從F值可知,各因素對(duì)離心沉淀率的影響程度順序依次為:C(結(jié)冷膠用量)>B(羧甲基纖維素鈉用量)>A(黃原膠用量)。

表6 響應(yīng)面方差分析Table 6 Analysis of variance of response surface experiment

2.2.2.2 響應(yīng)曲面分析 復(fù)合穩(wěn)定劑中黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結(jié)冷膠的交互作用及對(duì)離心沉淀率的影響見(jiàn)圖8所示。從圖8可知,穩(wěn)定劑添加有利于該飲料的離心沉淀率下降,但下降至一定值后趨于增大,結(jié)冷膠與羧甲基纖維素鈉之間曲面坡度較大,等高線呈橢圓形，交互作用顯著。

圖8 不同穩(wěn)定劑用量對(duì)離心沉淀率的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface map of different components amounts on centrifugal sedimentation rate

2.2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用響應(yīng)面法分析,確定飲料中復(fù)合穩(wěn)定劑最佳配比參數(shù)為:黃原膠0.14%、羧甲基纖維素鈉0.40%、結(jié)冷膠0.08%,離心沉淀率最低預(yù)測(cè)值1.08%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得飲料的實(shí)際沉淀率為1.05%±0.01%,與預(yù)測(cè)結(jié)果相近,飲料放置6個(gè)月后,見(jiàn)圖9所示,無(wú)明顯沉淀與分層。

圖9 不同貯藏條件的樣品穩(wěn)定性比較Fig.9 Comparison of stability of samples in different storage conditions注:從左至右:0月樣品、4 ℃樣品、37 ℃樣品。

2.3 抗氧化性

利用自由基清除劑的體外模型研究方法[21-22],通過(guò)考察?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料(?；撬?0.03%)和HN飲料(?；撬?0.05%)對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基與DPPH自由基的清除能力,來(lái)比較各自的抗氧化活性,結(jié)果見(jiàn)表7所示。從表7可見(jiàn),?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料對(duì)羥基自由基的清除能力顯著低于HN飲料(P<0.05),而對(duì)其它兩種氧自由基的清除率,?；撬岜『蓮?fù)合運(yùn)動(dòng)飲料均極顯著高于HN飲料(P<0.01),表明低于常規(guī)濃度的牛磺酸與薄荷組成的復(fù)合物有助于增強(qiáng)抗氧化活性。

表7 不同飲料對(duì)三種自由基清除率Table 7 The scavenging rates of different beverages against three kinds of oxygen radicals

3 結(jié)論

本研究以?；撬帷⒈『蔀樵?輔以白砂糖、黃原膠、羧甲基纖維素鈉與結(jié)冷膠研制復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料。通過(guò)單因素與正交試驗(yàn)確定飲料中原料液最佳配比參數(shù)為:?；撬?.03%、薄荷液6%、白砂糖3%、感官評(píng)價(jià)達(dá)到(87. 3±0.9)分;通過(guò)單因素與響應(yīng)面分析試驗(yàn)確定飲料中復(fù)合穩(wěn)定劑的最佳配比參數(shù)為:黃原膠0.14%、羧甲基纖維素鈉0.40%、結(jié)冷膠0.08%,離心沉淀率為1.05%±0.01%。根據(jù)上述最佳配比參數(shù)制得的復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料的薄荷氣味濃郁,色澤均勻、透亮,呈淺黃色,酸甜適中,具有清涼感,無(wú)明顯沉淀與分層。該復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲料在降低牛磺酸常規(guī)用量的同時(shí),具有較好的抗氧化作用效果,對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率分別為42.76%、65.25%和57.46%,因而具有較好的推廣前景。