菟絲子總黃酮提取工藝及其抗氧化活性

秦晶晶,錢慧琴,魏 婧,高 利,袁鐵峰,閆福林

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453200)

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子(CuscutaaustralisR. Br.)或菟絲子(CuscutachinesisLam.)的干燥成熟種子[1]。中藥菟絲子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并列為上品,其味甘性溫,歸肝、腎、脾經(jīng),具有補(bǔ)腎益精、止瀉安胎、養(yǎng)肝明目之功效,是中醫(yī)壯陽、補(bǔ)腎、固精之要藥[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),菟絲子的主要有效成分為黃酮類、多糖、木脂素等,其中黃酮類成分具有抗氧化、清除自由基、抗癌防癌、改善心腦血管循環(huán)和調(diào)節(jié)血壓等作用[4-7],具有很高的營養(yǎng)保健價值。

目前對菟絲子總黃酮提取的研究有一些報道,一般采用回流提取法、超聲提取法、冷浸法、超聲波協(xié)同復(fù)合酶等方法提取菟絲子中總黃酮[8-11],秦晶晶等[6]比較回流提取法、超聲提取法、冷浸法、微波輔助提取法和索氏提取法提取菟絲子中總黃酮得率,發(fā)現(xiàn)得率由高到低依次為:回流提取法、微波輔助萃取法、索氏提取法、超聲提取法、冷浸法?；亓魈崛》椒ň哂泻啽阋仔?、溶劑可回收利用、經(jīng)濟(jì)節(jié)約、提取率高的優(yōu)點(diǎn)。但響應(yīng)面曲法優(yōu)化菟絲子中總黃酮回流提取工藝及其體外抗氧化性研究未見文獻(xiàn)報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菟絲子 安徽亳州市藥材總公司提供,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室鑒定為旋花科植物(CuscutaaustralisR. Br.)的干燥成熟種子;蘆丁對照品 購自中國食品藥品檢定研究院(批號:100080-201408);1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH) 購自東京化成工業(yè)株式會社(CAS:1898-66-4);95%乙醇、NaNO2、FeSO4、焦性沒食子酸等試劑均為分析純 購于天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

電子分析天平 上海象平儀器儀表有限公司;SG-4054型數(shù)控精密恒溫水浴鍋 上海碩光電子科技有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;SHZ-3型循環(huán)水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠;101-8型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 江蘇金壇市佳美儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菟絲子總黃酮的提取 菟絲子在60 ℃恒溫干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,過40目篩,得菟絲子粉;稱取0.1 g菟絲子粉置于圓底燒瓶中,在一定的提取溫度、乙醇液料比、乙醇濃度和提取時間的條件下進(jìn)行總黃酮的回流提取,然后將得到的提取液抽濾,定容至25 mL容量瓶,備用。

1.2.2 總黃酮的測定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品25 mg,置于50 mL容量瓶中,加入少量95%乙醇溶解并定容至刻度,搖勻即得蘆丁對照品溶液(5 mg/mL)。精密吸取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中,各加水至5.0 mL,分別加入5%亞硝酸鈉0.6 mL,搖勻,放6 min,加入10%硝酸鋁0.6 mL,搖勻后放置6 min,加入4% NaOH 3.0 mL,加水至刻度,搖勻后放置15 min。于506 nm波長處測定吸收度A[9],以蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸收度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=0.0107x+0.0254,R2=0.9997。

1.2.2.2 菟絲子總黃酮的測定 準(zhǔn)確量取樣品溶液0.8 mL于10 mL比色管中,按照“1.2.2.1”中所述方法進(jìn)行操作,按下式計(jì)算黃酮得率。

式中:W表示黃酮得率,mg/g;c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數(shù);m表示藥材取樣量,g。

1.2.3 單因素對黃酮提取量的影響 考察單因素乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%),提取溫度(50、60、70、80、90 ℃),料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL),提取時間(30、60、90、120、150 min)對黃酮提取量的影響,乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時間四個因素的固定水平分別為70%、70 ℃、1∶30 g/mL、60 min,在對各因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)探究時,其他因素均取固定水平。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,按照Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以總黃酮提取量為響應(yīng)值,選取乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)四因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 菟絲子總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.5.1 菟絲子總黃酮對DPPH自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到菟絲子總黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的樣品溶液。參考焦坤鵬等[17]的方法進(jìn)行DPPH清除活性的測定,并以抗壞血酸作為參照比較效果,按以下公式計(jì)算清除率及IC50。

1.2.5.2 菟絲子總黃酮對羥自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到的菟絲子總黃酮濃縮液加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5、4.5、5.0 mg/mL的樣品溶液。參考文獻(xiàn)[18-20]進(jìn)行羥自由基清除活性測定,同時與抗壞血酸對比,按以下公式計(jì)算清除率及IC50。

1.2.5.3 菟絲子總黃酮對超氧自由基清除活性的測定 將最佳工藝條件下得到的菟絲子總黃酮濃縮液為原料液,并加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.03、0.06、0.08、0.10、0.14、0.20、0.24、0.26 mg/mL的樣品溶液。采用鄰苯三酚自氧化法,參考文獻(xiàn)[21-23]進(jìn)行超氧自由基清除活性測定并與抗壞血酸作比較,按以下公式計(jì)算清除率及IC50。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2007、Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同乙醇濃度對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度為50%～80%時,所提取黃酮質(zhì)量隨著乙醇濃度增大而增加,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時,黃酮得率最高,為23.36 mg/g。而當(dāng)乙醇濃度大于80%時,黃酮得率反而減小,這可能因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度達(dá)到一定程度之后可能會影響黃酮類溶解性及其醇溶性雜質(zhì)、色素增多,這些雜質(zhì)會與黃酮競爭溶劑,導(dǎo)致黃酮類化合物的溶解度降低。因此,選擇乙醇濃度70%～90%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 不同乙醇濃度對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.1 The effects of different ethanol concentrations on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.1.2 不同提取溫度對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖2可知，當(dāng)提取溫度為50～80 ℃時,菟絲子黃酮得率隨著提取溫度的升高而升高,當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時,總黃酮得率達(dá)到最大,為26.82 mg/g。當(dāng)提取溫度高于80 ℃,黃酮得率反而降低,這可能由于溫度升高導(dǎo)致分子運(yùn)動增加,使黃酮與溶劑接觸增加,故黃酮得率增加,但溫度太高的話,會導(dǎo)致部分黃酮氧化,使黃酮得率降低。因此,選擇提取溫度70～90 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 不同溫度對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.2 The effects of different extraction temperatures on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.1.3 不同料液比對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖3可知，隨著提取料液比的增加,菟絲子中總黃酮得率也增加,當(dāng)料液比為1∶10 (g/mL)時,菟絲子總黃酮得率達(dá)到最大,為26.82 mg/g。再繼續(xù)加大提取料液比,菟絲子中總黃酮得率反而降低。其原因可能是在料液比為一個合適范圍時,隨料液比的增加會促進(jìn)黃酮物質(zhì)的溶出,而料液比過高時,會加大其他雜質(zhì)的溶出或者部分黃酮類化合物與溶劑長時間接觸會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞,使得黃酮得率降低。因此選擇料液比為1∶5～1∶15 (g/mL)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 不同料液比對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.3 The effects of different material-liquid ratios on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.1.4 不同提取時間對菟絲子黃酮提取工藝的影響 由圖4可知:提取時間在30～90 min時,總黃酮得率隨著提取時間延長而明顯增加;提取時間為90 min時,總黃酮得率達(dá)到最大,為26.89 mg/g;提取時間超過90 min時,黃酮得率隨著時間的增加反而降低,這可能是由于乙醇具有揮發(fā)性,時間越久乙醇濃度越小,提取溶劑極性變大,導(dǎo)致一些極性小的黃酮類化合物析出來,從而使測得黃酮類化合物的含量偏低。因此選擇提取時間80～100 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 不同提取時間對菟絲子黃酮提取工藝影響Fig.4 The effects of different extraction time on extraction process of total flavonoids from Cuscuta chinesis

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken 的中心組合原理為依據(jù),以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取(D)為自變量,總黃酮得率為因變量,采用4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design Expert 8.0.6軟件建立數(shù)字回歸模型,確定菟絲子總黃酮最佳提取工藝條件,結(jié)果見表2。利用軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合,獲得的回歸模型方程如下:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment

Y=17.24-0.72+3.66B+2.52C-0.54D+3.57AB-2.78AC-1.89AD-1.33BC+0.81BD-1.39CD+2.92A2+1.06B2+3.08C2+2.68D2

由4個影響因素的F值大小可以得出,各因素對菟絲子總黃酮得率的影響順序?yàn)樘崛囟?料液比>乙醇濃度>提取時間,提取溫度對菟絲子總黃酮得率有較大影響。模型一次項(xiàng)D與交互項(xiàng)BD差異不顯著(P>0. 05)；一次項(xiàng)B、C,交互項(xiàng)AB、AC、AD以及二次項(xiàng)A2、C2、D2對菟絲子總黃酮得率均有極顯著的影響(P<0.01)；一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)BC、CD，二次項(xiàng)B2具有顯著的影響(P<0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面坡度越陡峭,說明響應(yīng)值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,該因素的改變對響應(yīng)值的影響也就越小,各因素交互作用對菟絲子中總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖5所示。在有交互作用的影響下,乙醇濃度和料液比，乙醇濃度和提取時間，乙醇濃度和提取溫度,料液比和提取溫度，提取時間和提取溫度其曲線比較陡,表明該因素對菟絲子總黃酮的提取的交互影響作用顯著,而料液比和提取時間、交互影響作用不顯著,這與表3中交互項(xiàng)值的分析一致。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖5 各因素交互作用總黃酮得率的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of total flavonoids

2.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證

通過軟件對二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析預(yù)測,乙醇回流提取菟絲子總黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇濃度為90.0%,提取溫度為70.41 ℃,提取時間為99.83 min,料液比為 1∶14.99 (g/mL)。綜合考慮將其最佳工藝條件調(diào)整為乙醇濃度90%,提取溫度為70 ℃,提取時間為100 min,料液比為 1∶15 g/mL,以此條件下對建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表4。獲得的菟絲子總黃酮得率的實(shí)際測得值為(34.65±0.02) mg/g,預(yù)測值為34.37 mg/g,預(yù)測誤差為0.81%,小于3%,因此,證實(shí)了預(yù)測值的準(zhǔn)確可靠。

表4 最優(yōu)條件的預(yù)測值和實(shí)測值(n=3)Table 4 The predicted value and measured value of the optimal conditions(n=3)

2.4 菟絲子總黃酮體外抗氧化活性

2.4.1 菟絲子總黃酮對 DPPH·清除作用 由圖6可知,在選定濃度0.03～0.20 mg/mL范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的提高而增強(qiáng),當(dāng)濃度增加為0.24 mg/mL,清除率達(dá)到98.68%,此后其清除率基本趨于平衡。根據(jù)SPSS 20.0軟件數(shù)據(jù)分析,得到菟絲子總黃酮IC50=0.067 mg/mL和抗壞血酸的IC50=0.082 mg/mL,這說明在相同濃度下,菟絲子總黃酮對DPPH·清除率略高于抗壞血酸。

圖6 不同濃度的菟絲子總黃酮和抗壞血酸對DPPH的清除率Fig.6 DPPH· scavenging activities of different concentrations of ascorbic acid and total flavonoids

2.4.2 菟絲子總黃酮對·OH的清除作用 由圖7可知,在選定濃度0.5～5.0 mg/mL范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的提高而增強(qiáng),當(dāng)濃度增加為4.5 mg/mL,清除率達(dá)到40.42%,此后其清除率增加不明顯,基本趨于平衡。根據(jù)SPSS 20.0軟件數(shù)據(jù)分析,得到菟絲子總黃酮IC50=7.209 mg/mL和抗壞血酸的IC50=1.731 mg/mL,這說明在相同濃度下,菟絲子總黃酮對·OH清除率比抗壞血酸弱。

圖7 不同濃度的菟絲子總黃酮和抗壞血酸對·OH的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of different concentrations of ascorbic acid and total flavonoids

圖8 不同濃度的菟絲子總黃酮和抗壞血酸對的清除率 scavenging activities of different concentrations of ascorbic acid and total flavonoids

3 結(jié)論

本文通過回流提取法提取菟絲子中總黃酮,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)曲面法對菟絲子總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)獲得的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為90%,提取溫度為70 ℃,提取時間為100 min,料液比為 1∶15 (g/mL),獲得的菟絲子總黃酮得率的實(shí)際測得值為(34.65±0.02) mg/g,預(yù)測值為34.65 mg/g,預(yù)測誤差為0.81%,說明采用Box-Behnken方法優(yōu)化提取總黃酮工藝行之有效,為以后菟絲子總黃酮的產(chǎn)業(yè)化提供指導(dǎo)。

體外抗氧化活性研究表明,菟絲子總黃酮對 DPPH·、羥自由基和超氧陰離子自由基的IC50值分別為:0.067、7.209、0.119 mg/mL,具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性,為其在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。